海南省气候对“候鸟”高血压患者炎性因子和miR-146a的短期影响

朱连荣，彭志晴，刘文徽，李楠，蓝云锋，贾国栋

方法：共纳入90例研究对象，其中高血压组60例和正常对照组30例。测量并记录两组人群初到海南1周内、1个月和3个月后的血压情况，比较两组人群的血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β以及PBMC内miR-146a基因的表达情况。

结果：与1周内相比，高血压患者1个月和3个月收缩压和舒张压明显降低（P均＜0.05），TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及miR-146a基因表达也明显下调（P＜0.05）。miR-146a基因与TNF-α、IL-1β呈显著正相关（P＜0.05），而与IL-6无显著相关性（P＞0.05）。正常对照组的血压水平、血清炎性因子浓度和miR-146a基因表达在三个时间段无明显差异。

结论：高血压患者在海南居住1个月后血压改善，可能与TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及miR-146a基因表达降低有关。

高血压病是多系统、多因素综合作用的结果，越来越多的研究资料显示高血压常伴随着免疫功能异常，单核细胞是慢性炎症的重要参与者[1]，分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[2]、白细胞介素6 （IL-6）[3]和白细胞介素1（IL-1β）[4]在内的多种细胞因子和趋化因子[1，5]，这些炎性因子在高血压发生、发展中起重要的作用[6]。近年的研究提示，微小RNA （miR）在心血管系统疾病的发生、发展过程中起了重要作用，TNF-α和IL-1β刺激单核细胞后， 可以通过核转录因子（NF）-κB方式诱导miR-146a基因表达[7]。“候鸟”人群是指以追求高质量的生活为目标，以气候为基础的短期季节性迁徙的人群，其生活方式、疾病类型和医疗需求与海南常住人口有明显差异。本研究旨在了解海南地区“候鸟”高血压患者的血压改善情况，并探讨外周血单核细胞（PBMC）内miR-146a基因的表达与血清TNF-α、IL-6和 IL-1β水平的相关性。

1 资料与方法

研究对象：采集2014-10至2015-03期间在解放军总医院海南分院就诊的单纯高血压患者以及健康查体者。纳入标准为：（1）海南省户籍以外，男女不限，年龄≥40岁；（2）初次到达海南岛，入岛时间在7天以内；（3）单纯高血压患者已服药治疗；（4）计划在海南生活时间≥6个月；（5）经体检除外感染、肿瘤、免疫系统缺陷、严重肝肾功能不全等疾病以及应用炎症抑制药物者；（6）高血压患者入组后服用降压药和（或）其他药物与入组前相比未做改变。能定期监测血压，按时随访。入选对象均经解放军总医院海南分院医学伦理委员会批准，并与本人签署知情同意书。

分组：高血压组：选择冬季迁徙居住在海南地区的“候鸟”人群中在我院住院和门诊随诊的原发性高血压患者60例（男性37例，女性23例），平均年龄（59.9 ±11.2）岁。符合2010年《中国高血压防治指南》高血压诊断标准[8]。正常对照组：选择同期年龄、性别相匹配的在本院门诊体检的健康“候鸟”人群30例（男性16例，女性14例），平均年龄（54.5±7.9）岁；其血压水平从未发现异常，收缩压和舒张压长期分别在 90～140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和60～90 mmHg之间。

研究方法：按照“候鸟”人群居住时间分为四个时期：1期：初到海南1周内；2期：到海南1个月；3期：到海南3个月；4期：到海南4～6个月（由于4期失访率超过40%，故未纳入统计）。“候鸟”人群在到达海南1周内、1个月和3个月时共测量三次血压水平。

实验室检查：血清TNF-α、IL-6 和IL-1β的水平测定采用酶联免疫吸附法（ELISA），检测方法严格按照说明书步骤由课题组同一人完成。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC，实时定量多聚酶链式反应（Real-time PCR）法检测PBMC内miR-146a的表达。分离的PBMC，用一步法多聚酶链式反应（PCR）提取细胞总RNA。提取的RNA经电泳鉴定未被降解， 再用72-1分光光度计测260 nm和280 nm范围的吸光度值A260 和 A280，所有样品的A260/A280比值介于1.9～2.1 。根据A260对样品的总RNA进行初步定量。用TaKaRa实时定量试剂盒配置25 μl反应体系。采用miScript Reverse Transcription试剂盒进行逆转录反应，取5 μl cDNA模板采用mi Script Primer assay 和mi Script SYBR Green PCR试剂盒进行PCR。miR-146a 基因扩增应用miScript通用引物及其各自炎性指标特异性引物，同时以5S作为内参，最终在ABI 7500 Real-time PCR仪测定其相对表达量。上述试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司， 具体操作步骤均按照说明书进行。

统计学方法：使用 SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，数据类型符合正态分布数据，进行比较采用单因素重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组受试者的一般临床资料及血压水平比较（表1）：高血压组和正常对照组性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。高血压组中，与 1期比较，患者在2期和3期时的血压明显下降，差异均有统计学意义（P均 ＜0.05），与2期比较，3期时的血压虽有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组的血压平稳，三个时间段的血压差异均无统计学意义（P均 ＞0.05）。

表1 两组受试者的一般临床资料及血压水平比较（±s）

表1 两组受试者的一般临床资料及血压水平比较（±s）

注：与同组1期比较*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

候鸟人群居住时间1期 (1周内) 2期 (1个月) 3期 (3个月)收缩压 (mmHg) 舒张压 (mmHg)收缩压 (mmHg)舒张压 (mmHg) 收缩压 (mmHg) 舒张压 (mmHg)正常对照组 30 16/14 54.5±7.9 121.0±6.6 67.0±8.4 122.0±9.3 66.0±7.4 118.0±10.1 68.0±4.9高血压组 60 37/23 59.9±11.2 144.0±17.2 82.0±8.9 130.0±14.6 * 68.0±7.3 * 126.0±31.4 * 67.0±5.6 *分组 例数 男/女 (例) 年龄 (岁)

两组受试者血清炎性因子水平比较（表2）：（1）与正常对照组比较，高血压组1期～3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）在高血压组患者中，与1期比较，2期和3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）正常对照组中，三个时间段的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平变化差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两组受试者的炎性因子水平比较（±s）

表2 两组受试者的炎性因子水平比较（±s）

注：TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素6；IL-1β：白细胞介素1β。与同期正常对照组比 *P＜0.05；与高血压组I期比△P＜0.05

候鸟人群居住时间1期 (1周内) 2期 (1个月) 3期 (3个月)正常对照组 (n=30) 高血压组 (n=60) 正常对照组 (n=30) 高血压组 (n=60) 正常对照组 (n=30) 高血压组 (n=60)TNF-α (pg/ml) 1.847±0.09 2.89±0.31* 1.82±0.67 2.45±0.10 * △ 1.78±0.09 2.33±0.17*△IL-1β (ng/ml) 6.61±0.91 10.31±0.55* 4.81±0.21 9.22 ±0.11 * △ 4.64±0.39 8.70±0.75*△IL-6 (pg/ml) 135.12±19.44 277.31±32.89* 129.76±20.11 240.38± 60.43 * △ 131.55±9.12 188.93 ±17.98*△项目

两组受试者外周血PBMC内miR-146a基因的表达（图1）：以同时间点正常对照组受试者的PBMC内miR-146a基因表达表示为1，则高血压组患者在1期、2期和3期时的外周血PBMC内miR-146a基因表达下调，差异均有统计学意义（P均＜0.05），而且随着时间推移PBMC内miR-146a表达逐渐降低（P均＜0.05）。（2）正常对照组三个时间点的外周血PBMC内miR-146a基因表达随时间延长有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 两组受试者外周血单核细胞（PBMC）内 miRNA-146a基因变化

外周血PBMC内miR-146a基因表达及血清炎性因子水平的相关性：miR-146a基因与TNF-α（r=0.601，P=0.012 ）、IL-1β（r=0.583，P=0.034 ）呈正相关（P＜0.05），而与 IL-6（r=0.210，P=0.186 ）无显著相关性。

3 讨论

高血压人群患病率呈逐年上升趋势[9]，2010年第六次全国人口普查数据测算高血压患病人数约为2.7亿，主要以药物治疗为主。多项研究从多方面揭示了血清炎性因子与疾病的发生和发展密切相关[5，10-13]，血清炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等在高血压的发病机制中可能起重要作用。

本研究结果表明，“候鸟”高血压人群到达海南1期、2期、3期（1周、1个月及3个月）后血压呈梯度下降，与到达海南1期血压比较，2期和3期后的收缩压和舒张压均显著降低（P＜0.05），提示高血压患者在海南生活1～3个月可改善血压。海南季节性老年人口迁入使冬季心脑血管意外事件频发，其中常见心原性猝死，因其发病急、后果严重而严重危害潜在人群生命健康[14]，本研究发现入岛“候鸟”老人存在着血压变化，为高危人群的早期识别和正确的干预提供了证据。

“候鸟”高血压组患者到达海南1～3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均较正常对照组高（P＜0.05），提示高血压病患者血清炎性因子处于激活状态，抑制炎性因子的激活可能是治疗高血压的新靶点。“候鸟”高血压人群到达海南1周内的血清TNF-α、IL-1β和IL-6三个炎性因子初始检测水平较1个月后明显升高，提示该初始检测得到的水平可能为高血压人群的负荷状态。随着高血压组成员到达海南后时间延长，PBMC内miR-146a基因表达随时间长度呈梯度下调，与三个炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降趋势相仿，提示炎性因子可能是高血压病的独立危险因子。

已有研究显示高血压患者血清TNF-α水平上升可引起血管内皮损伤[15，16]，当血压升高时，血管内皮细胞受损及平滑肌细胞增生，均可产生TNF-α。推测TNF-α与血压水平相互协同，血管内皮长期经受较高的血压及异常血流的循环会发生损伤，进而激活炎症反应系统，促使组织和器官产生大量炎性因子；反之，高水平炎性因子所引起的炎症反应进一步加重内皮细胞损伤，促使血流阻力增加及血管壁弹性降低，使血压值升高。近年来，我们在临床实践中观察到药物治疗为主，辅以平稳的自然生活环境，对包括高血压在内的慢性病能够得到明显的治疗效果。本研究显示”候鸟”高血压人群血压水平与血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6三个炎性因子水平呈正相关，随着高血压患者血压水平的降低，其血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6三个炎性因子水平也同步下降。本研究从时间和空间的角度比较了高血压的变化，高血压患者从内地到海南1周内的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子水平均处于监测期间最高水平，1个月后的炎性因子水平明显降低，随访期间检测炎性因子水平与监测血压水平降低趋势相仿，3个月后随访结束，高血压患者的血压和炎性因子均处于随访期间最低值，虽然仍高于正常对照组，但血压的明显改善使内皮细胞损伤减轻。本研究结果提示海南良好的冬春气候对高血压患者康复具有正面效应。

本研究从更年轻的“候鸟”人群中（40～60岁）佐证了前期课题组的结论，即海南“候鸟”老人（＞60岁）的慢性病康复得益于优越的气候环境[17]。为了进一步验证结果的可靠性，我们参考miR-146a基因表达调节免疫反应的一项研究[18]，用逆转录多聚酶链式反应法测定各期miR-146a的表达情况，高血压组患者到达海南1周、1个月及3个月后的时间里，PBMC 内miR-146a基因表达逐渐下调。随着监测期间的血压逐渐降低，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的下降，miR-146a基因表达同步减弱，统计学分析显示miR-146a基因表达与TNF-α和IL-1β水平呈显著正相关，IL-6虽同步降低，但与miR-146a无相关关系，可能是样本量较小和（或）实验误差的原因。miR-146a基因表达与炎性因子TNF-α和IL-1β呈正相关也进一步从基因角度验证了连续生活3个月的时间高血压人群的血压水平明显得到改善，也表明基因研究的进展有助于高血压的临床诊断和治疗[19]。对生活4个月以上的人群血压我们未能找到足够样本进行比较，随着时间延长，推测这种改善将会持续。“候鸟”人群离岛后的血压是否恢复入岛时的水平需要进一步研究。海南岛是个四季温差较小的地方[20]，当药物对病情的控制难以满意时，自然环境似乎是一个有希望的新途径[21,22]。