耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制与分子流行病学特征

张志军，鹿 麟，牛法霞，赵 珂，姜梅杰，赵书平

(1 泰安市中心医院, 山东 泰安 271000; 2 同济大学附属东方医院, 上海 200120; 3 胜利油田中心医院, 山东 东营 257000; 4 泰山医学院, 山东 泰安 271016)

碳青霉烯类抗生素作为治疗产超广谱β-内酰胺酶及多重耐药肺炎克雷伯菌感染的首选药物受到广泛关注，近年来随着临床上对该类药物应用的增加，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)已呈全球性播散，对临床感染的治疗造成极大的威胁[1]。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制，碳青霉烯酶可广泛水解包括碳青霉烯类在内的所有β-内酰胺类抗生素，并可随着质粒播散而导致大范围的流行[2]。美国疾病控制与预防中心将CRKP列入了目前“最棘手的细菌”[3]。为此，本研究对2014年泰安市中心医院临床感染标本中分离获得的13株CRKP的耐药基因携带情况及分子流行病学特点进行了分析，旨在为临床治疗此种细菌引起的感染提供实验室依据，同时有助于及时有效的控制其流行。

1 资料与方法

1.1 资料来源 2014年1—11月医院临床各类标本中分离的所有CRKP菌株(剔出同一患者相同部位检出的重复菌株)，共计13株。

1.2 菌株鉴定与药敏试验 细菌的分离、培养严格按照《全国临床检验操作规程》(第3版)进行，使用WalkAway 96 PLUS型全自动细菌分析仪进行鉴定和药敏试验，替加环素的敏感性使用Etest法。

1.3 改良Hodge试验及EDTA 协同试验 参照文献[3]报道的方法进行检测。

1.4 耐药基因检测 采用多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)方法检测碳青霉烯酶基因blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaNDM-1等，引物序列参照文献[4-5]，对阳性基因进行测序，PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行检测，结果进行BLAST序列比对分析。

1.5 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)和多位点序列分型 (multilocus sequence typing，MLST) PFGE参照文献[6]的方法进行，参考菌株为沙门菌H9812，应用Gel Doc系统对图像(Bio-Rad，美国)进行拍照。MLST中肺炎克雷伯菌7个管家基因的引物序列、反应体系及反应条件参见MLST网站，测序结果通过MLST数据库进行比对，获得该菌株相应的序列型别(sequence type，ST)，使用eBURST软件分析STs之间的进化关系。

2 结果

2.1 菌株检出情况 13株CRKP的标本来源主要是痰及尿，分别为7株(53.85%)和4株(30.77%)，1株(7.69%)分离自血标本，1株(7.69%)分离自分泌物。CRKP主要来源于各重症监护病房(ICU)，其中神经外科ICU、老年一科病房、急诊科ICU、综合ICU各检出2株，血液内科病房、口腔科门诊、儿内二科病房、新生儿ICU、泌尿外科病房各检出1株。分离出CRKP菌株的患者多数有基础性疾病、外伤或免疫力低下，病情较为严重，如脑出血、多器官损伤等，13株CRKP来源情况见表1。

表1 13株CRKP标本来源、科室分布及患者情况Table 1 Specimen sources, department distribution, and patients’ condition of 13 CRKP strains

表2 CRKP对主要抗菌药物的药敏试验结果[株数(%)]Table 2 Antimicrobial susceptibility testing results of CRKP(No. of isolates [%])

2.3 改良Hodge试验及EDTA 协同试验结果 13株CRKP改良Hodge试验均为阳性；5株菌EDTA协同试验阳性，分别为Kp4、Kp8、Kp9、Kp10与Kp12，其余为阴性。见图1和图2。

2.4 耐药基因检测结果 取KPC阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果均为 KPC-2 基因，与编码 CP028790.1序列100%同源，碳青霉烯酶基因中KPC-2型最常见(13/13)，见图3。取NDM-1阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果均为NDM-1 基因，与编码CP028786.1序列100%同源，有5株细菌该基因阳性(5/13)，见图4。未检测到blaIMP、blaVIM、blaGIM基因。

图1 部分改良Hodge试验结果Figure 1 Modified Hodge test results of partial strains

图2 部分EDTA协同试验阳性结果Figure 2 Positive results of EDTA-disk synergy test of partial strains

注：M为DNA标志物；Kp1—Kp13均为blaKPC基因阳性

注：M为DNA标志物；Kp4、Kp8、Kp9、Kp10、Kp12为blaNDM-1基因阳性；Kp1—Kp3、Kp5—Kp7、Kp11、Kp13均为blaNDM-1基因阴性

2.5 PFGE分型及MLST结果 PFGE聚类结果显示，以85%作为界值可将13株CRKP分为5种型别，分别为A、B、C、D、E型，主要为C型(9/13)，且均属于ST11，其他型别为ST37、ST626、ST628和ST668，见图5。eBURST软件分析结果显示检出的ST11、ST37均属于克隆复合体CC258群，见图6。

图5 13株CRKP的PFGE分型结果和MLST型别Figure 5 PFGE typing results and MLST of 13 strains of CRKP

注：红色圆圈内数值表示本次实验中检测到的ST类型；红色方框内表示克隆复合体CC258

3 讨论

本研究中CRKP主要分离自各ICU及老年科病房，提示病情严重、体弱患者是主要的易感人群；这些菌株主要分离自痰，其次为尿，表明其主要定植在呼吸道，故应加强可疑感染CRKP重症患者的呼吸道细菌学检查，及时发现CRKP有助于临床用药及治疗，提高患者生存率。

大量研究[4-6, 10]表明，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的机制主要有以下几点：膜孔蛋白丢失，外排机制活跃，以及碳青霉烯酶的产生等，其中碳青霉烯酶(主要为KPC-2型碳青霉烯酶以及金属β-内酰胺酶)的产生是最主要的原因。然而，各地区间因抗菌药物使用不同，耐药基因的流行情况也存在一定差异。如张顺等[11]对宁波地区分离的CRKP菌株进行检测，发现KPC-2与IMP-4是该地区此类菌株中分离出的主要碳青霉烯酶基因，未发现NDM-1基因。王建友等[12]报道，乐清市地区3年间分离的CRKP菌株中，69.2%的菌株携带KPC-2型碳青霉烯酶，12.5%携带NDM-1基因，28.3%的菌株同时携带KPC-2和IMP-4，耐药基因呈多态性。而在北美地区[13]，除KPC-2和NDM-1碳青霉烯酶基因的检出率占绝对主导外，OXA-48型碳青霉烯酶的检出率也逐渐增高，但与国内不同。

13株CRKP均产KPC-2型碳青霉烯酶，说明KPC-2是该院肺炎克雷伯菌对亚胺培南等药物耐药的主要原因；5株(38.46%)细菌产NDM-1，且该5株菌EDTA协同试验阳性，说明该试验对金属酶检测的高度特异性；部分菌株同时携带两种碳青霉烯酶基因(KPC-2与NDM-1)，说明该院碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌中呈现多态性，这是造成该院CRKP广泛流行的根本原因，但同时携带两种碳青霉烯酶基因的菌株其耐药性与其他菌株并无明显差别，可能是因为部分基因并未表达或仅存在低水平表达。

近年来，相关研究[3, 14-15]显示，全球产KPC肺炎克雷伯菌的序列型主要为ST258，在美国、以色列和意大利流行。而国内学者俞云松等[16]研究发现ST11是我国的优势序列类型，ST11与ST258间只有一个管家基因(tonB)存在差别，同属于克隆复合体CC258。

本次研究结果显示该院流行的CRKP也以克隆类型ST11为主，同时也发现了ST37与ST628等，与国内的相关报道[6-7, 17]一致。PFGE结果显示，分离自不同病房的CRKP菌株(如Kp5与Kp10)具有100%的同源性(均为ST11)，提示该院的此类菌株在一段时间内存在暴发流行现象，由于菌株采集时间不同，来源科室也不同，可能由于医护人员的流通或患者住院科室的流转，滞留在物体表面或空气中的病原菌感染了其他患者，因此，临床医生应注意手卫生与医院感染防控，应对该院碳青霉烯酶基因进行调查追踪及分子流行病学的分析，有效掌控产不同碳青霉烯酶菌株的流行情况，为医院感染进一步的防控提供坚实的实验室基础。

CRKP在中国、希腊、美国的检出率较高[1, 3, 18]，在曾经分离率很低的欧洲国家也逐渐出现流行，对此类细菌的监测在相关感染预防控制中仍是一项重要措施。尽管各国的医疗机构、科研中心甚至包括政府部门都对CRKP予以高度关注，但其整体流行趋势尚未得到有效控制，因此，深入分析研究本地区分离的CRKP对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及流行病学特点，有助于进一步实施有针对性的预防控制措施。