近红外光谱技术测定苜蓿蛋白质含量的研究

纳 嵘，胡 波，史 蓓

（1.宁夏职业技术学院生命科学技术系，宁夏 银川 750021；2.宁夏大北农科技实业有限公司，宁夏 银川 750200）

优质牧草是草畜产业健康发展的重要保障，作为牧草产业发展首选的牧草之一，苜蓿是世界上栽培面积最广的牧草，素有“牧草之王”的美誉。苜蓿茎叶中含有丰富的蛋白质、粗纤维、矿物质、维生素和多种氨基酸等营养成分，是优质的粗饲料，同时也是精饲料的良好替代品和配合饲料的原料［1-2］。苜蓿众多营养成分中，蛋白质含量是衡量苜蓿营养价值的一个核心指标。

近年来，国家对饲料营养成分分析及动物营养的工作十分重视，目前在国内已建立了饲料营养成分的数据库。但由于饲料来源途径多样，原料采购标准难以实行，而常规分析方法耗时长、操作复杂、重复性差，已不适应畜牧业精细化、科学化发展的需要［3］。

近红外光谱分析是主要用于有机物质定性和定量分析的一种分析技术，是国内外发展较快的一种新型定性、定量分析技术。通过各类饲料定标曲线，可以检测从原料到成品饲料中的水分、淀粉、脂肪、蛋白、纤维、氨基酸、钙、磷、盐分等指标。其具有一次分析项目多，分析快速准确 （分析时间<1 min），无需样品前处理（化学处理），减少和降低化学试剂对环境的污染，且具有不破坏样品无损分析的特点，从而满足用户快速、准确的饲料检测需求［4-7］。

在草畜产业中，饲料化学成分检测是保证饲料产品质量与安全的重要技术手段之一［8］，因此，该研究拟采用近红外光谱技术扫描、收集苜蓿样品的近红外光谱，将样品的蛋白质含量值与相应的光谱数据相关联，利用化学计量学方法，建立预测性能良好、准确可靠的苜蓿蛋白质快速定量预测模型，从而实现苜蓿蛋白质含量的快速测定，为近红外光谱技术在饲料分析检测中的应用提供参考数据，并为发展牧草快速检测技术提供新思路和新方法，进一步推动草畜产业健康持续发展。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与试验试剂

1.1.1 仪器设备：近红外光谱分析仪DS2500F（丹麦Foss公司）；KDN-04A蛋白质测定仪（上海昕瑞仪器仪表有限公司）；试样粉碎机（上海科恒实业发展有限公司）；KND-20C消化炉（上海华睿仪器有限公司）。

图1 技术路线图

1.1.2 试验试剂：盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、硼酸、硫酸、硫酸铜、无水硫酸钠、溴甲酚绿、甲基红等。

1.2 试验材料

从2016年10月—2018年5月，共收集苜蓿干草样品63个，所有样品粉碎至90%以上，并通过0.425 mm的样品筛。选取其中的52个样品形成定标集，用以建立苜蓿蛋白质含量快速分析定标模型；其余11个样品组成样品验证集，用以验证定标模型准确性。

1.3 试验方法

1.3.1 样品成分的化学分析：采用凯氏定氮法（GB/T 6432—94）和蛋白质测定仪测定苜蓿样本集蛋白质含量。每个样品测定3次平行样本，取平均值作为化学测定值［9］。

1.3.2 样品的光谱扫描：分别扫描63个苜蓿样品（在1 100～2 498 nm波长范围内），每隔2 nm采集1次反射量（R），每份样品重复扫描4次，取平均值。使用光谱分析软件Win ISIⅢ对扫描后的光谱进行预处理和回归统计分析。

1.3.3 模型的建立和验证：采用FOSS公司Win ISIⅢ近红外光谱分析软件，将苜蓿定标集的蛋白质含量化学值与光谱数据相关联，分析建立的苜蓿蛋白质含量定标模型。通过内部验证和外部验证两种形式，评价定标模型的性能。内部验证以交叉验证标准误差（SECV）和交叉验证相关系数（1-VR）评价定标模型质量优劣程度，交叉验证标准误差（SECV）越小，交叉验证相关系数（1-VR）越大，证明模型的预测性能越好；外部验证利用验证集比较苜蓿验证集样品的模型预测值与测定值相关性，通过预测标准误差（SEP）评价模型预测性能，预测标准误差（SEP）越小，定标模型的预测性能越好［10］。

表1 苜蓿样品中蛋白质含量的化学分析结果

图2 苜蓿样本原始光谱图

2 结果与分析

2.1 苜蓿样品蛋白质含量的常规化学分析

按照国家标准（GB/T 6432—94），使用蛋白质测定仪对苜蓿样品蛋白质含量进行测定，并对其分析。由表1可知，苜蓿样品中蛋白质含量变化幅度较大，说明苜蓿样品来源较广泛，具备一定的代表性，可用来建立苜蓿蛋白质含量的近红外光谱预测模型。

2.2 样品的近红外光谱图与处理分析

图2为苜蓿样品经近红外光谱分析仪得到的近红外原始光谱图，其中横坐标代表光谱波长（nm），纵坐标为苜蓿样本的吸光度。对其分析可知苜蓿样品在1 100～2 498 nm的波长范围内有明显的吸收峰和基本相同的变化趋势，说明苜蓿样品的吸光度与其化学成分含量存在线性相关性，苜蓿的近红外原始光谱图可作为建立蛋白质含量快速检测模型。

对原始光谱图进行一阶导数处理后，可得到一阶导数处理后光谱。如图3所示，处理后的光谱消除噪声影响，吸收峰更加明显［11］。

2.3 定标模型的建立和验证

2.3.1 苜蓿蛋白质含量定标模型的建立：使用Win ISIⅢ近红外光谱分析软件，确定光谱数学处理方式为“1，4，4，1”，即导数处理采用一阶导数处理，导数处理数据间隔为4，平滑处理间隔为4，二次平滑处理间隔为1。将苜蓿蛋白质含量的化学分析值与光谱数据相关联，采用改进最小二乘回归法 （MPLS），建立苜蓿蛋白质含量分析定标模型。

图3 一阶导数处理后光谱图

2.3.2 苜蓿蛋白质含量定标模型的内部交叉验证：对苜蓿蛋白质含量定标模型进行内部交叉验证，分析内部交叉验证效果，其中交叉验证标准误差（SECV）为 0.433 5，交叉验证相关系数（1-VR）为0.920 1，1-VR＞0.90。证明苜蓿蛋白质含量化学分析值和光谱预测值之间具有一定的线性相关性，本次建立的苜蓿近红外定标模型具有较好的预测性能。

2.3.3 苜蓿蛋白质含量定标模型的外部验证：对已建立的苜蓿蛋白质含量定标模型进行外部验证，利用验证集比较苜蓿验证集样品的模型预测值与测定值相关性。经过验证，预测标准误差（SEP）为0.264 0。如图4所示，苜蓿验证集的光谱预测值与化学测定值之间有较好的线性相关关系，说明定标模型可以较好地预测苜蓿蛋白质含量。

如上所示，通过对模型的内部交叉验证和外部验证后，说明苜蓿蛋白质含量的近红外定标模型具有较好的预测性能。

3 讨论与结论

该试验在前人研究的基础上，采用改进最小二乘回归法（MPLS），数学处理方式为“1，4，4，1”，使用Win ISIⅢ光谱分析软件建立苜蓿蛋白质含量分析的预测模型。通过对已建立的苜蓿蛋白质含量定标模型进行内部交叉验证和外部验证，证明该定标模型较稳定，能够准确地对苜蓿的蛋白质含量进行快速检测分析，为近红外光谱分析技术在饲料检测领域的应用提供了理论依据。

图4 样品验证集的光谱预测值与化学测定值的关系