改良硫酸—蒽酮法测定双黄连粉针剂中总糖的含量

冯文军　李文春　解黎雯　李殿明　付饶

摘 要：目的：建立双黄连粉针剂中总糖的含量测定方法。方法：以葡萄糖为对照品，以改良硫酸-蒽酮分光光度法测定双黄连粉针剂糖总糖的含量。结果：供试液在50分鐘内显色稳定，重现性好，平均回收率为99.88%，RSD为1.83%。双黄连粉针剂总糖含量为37.72%。结论：该方法简便，快速，测定结果客观，准确。

关键词：双黄连粉针剂；总糖；含量测定；改良硫酸-蒽酮法

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）13-0186-03

根据中药注射剂安全性再评价的相关要求，《中药注射剂安全性再评价质量可控性评价技术原则》（征求意见稿）明确指出：“多成份制成的注射剂结构明确成分的含量因品种而异；所测各类成分之和应尽可能大于总固体的80%。”“多成份制成的注射剂，含测指标的选择应为大类成份含测加单一成份含测，如：某注射剂中含黄酮、皂苷、生物碱等，需要分别建立总黄酮、总皂苷、总生物碱类的测定，还需分别对黄酮、皂苷、生物碱中的单一代表成份进行含量含测（HPLC或GC法等）。”因此建立双黄连粉针剂的总糖含量测定指标，以加强制剂质量控制。

1 仪器与试药

METTLER XS205型 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（瑞士）公司）；TU-1901型 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；取液器（Eppendorf Research，0.2mL、1mL、5mL）；具塞玻璃试管（10mL）；石英比色杯；D-葡萄糖（分析纯，北京益利精细化学品有限公司）；蒽酮（分析纯，中国上海五联化工厂）；硫酸（分析纯，吉林威龙化学试剂有限公司）；0.2%蒽酮硫酸溶液[称取0.2g蒽酮，溶于浓硫酸（98%）100mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内（临用现配）]；双黄连粉针剂（哈药集团中药二厂，喷干，规格：0.6g，0903237、0903238、0903239、1001230、1001231、1001232、1005206、1005207、1005208）；注射用双黄连（哈药集团中药二厂，冻干，规格：0.6g，0902004、0902005、0902006）；注射用双黄连（哈药集团中药二厂，冻干，规格：1.2g，1002102、1002103、1002104）。

2 试验方法与结果

2.1 试验方法

通过对糖含量方法的反应原理研究，认为硫酸-蒽酮法测定可溶性糖较适合双黄连粉针剂中总糖的含量测定，研究中该方法有两种显色方式[1-2]，即一种在沸水中加热10分钟，另一种是应用硫酸加入供试品溶液中发热反应显色称之为改良硫酸-蒽酮法（硫酸水合热法），通过文献认为，改良法较经典法更加科学，方便简单，因此双黄连粉针剂总糖的含量测定采用改良法硫酸-蒽酮法。

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取葡萄糖100mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀得1mg/mL葡萄糖对照品溶液。精密吸取10mL至100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL 含葡萄糖100μg）。

2.1.2 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，各加水至2mL，加0.2%蒽酮浓硫酸溶液5mL，摇匀，避光放置30分钟，以0mL为空白，照分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在620nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，对照品重量为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3 供试品溶液的制备

取本品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL置10mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“加0.2%蒽酮浓硫酸溶液5mL……”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的重量，计算，即得。

2.2 显色条件研究

文献研究得知，显色的主要因素是硫酸与水的比例，通过设计实验考察硫酸与水的不同比例，确定最佳的显色比例。

试验方法：精密量取对照品溶液0.6mL，分别置10mL具塞试管中，各加水至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，加0.2%蒽酮浓硫酸溶液5mL，摇匀，避光放置30分钟，同时制备空白，照分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在620nm的波长处测定吸收度，同时检测1小时，每10分钟测一次，记录结果。

试验结果如表1所示。

通过实验认为显色稳定性均较好，仅2.5mL时偏差较大，2.0mL时的最大吸收波长与文献报道620nm一致，且吸收适中因此采用该加水比例显色。

2.3 最大吸收波长的确定

吸取对照品溶液0.6mL和供试品溶液2.0mL分别置10mL具塞试管中，各加水至2mL，加0.2%蒽酮浓硫酸溶液5mL，摇匀，避光放置30分钟，以水2.0mL如上法操作得空白溶液，于紫外可见分光光度计上，在400～800nm波长范围内进行扫描。结果对照品溶液在620.5nm波长处均有最大吸收，由于成品中含有多种糖故最大吸收与葡萄糖有差异，600.5nm，但其吸收在600-620nm之间几乎为平台变化很小，我们采用葡萄糖为标品，故确定测定葡萄糖的最大吸收波长620nm为检测波长。葡萄糖对照品紫外图谱如图1所示，双黄连粉针供试品溶液紫外图谱如图2所示。

2.4 线性关系的考察

研究方法：精密称取葡萄糖12.5mg，置100mL量瓶中，加水适量，使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL含葡萄糖0.10mg）。照2.1.2项下方法绘制标准曲线。以对照品量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=5.14433X-0.04034，相关系数为：r=0.9988。表明黄芩苷在0.025mg～ 0.125mg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取注射用双黄连（冻干）1002102，精密称定，2.1.3项下方法制备供试品溶液。依法进行测定6次。测定吸收值，结果平均值为0.3878，RSD=0.11%。由此可见，该方法精密度较好。

2.6 供试品溶液稳定性试验

取注射用双黄连（冻干）1002102，精密称定，照2.1.3项下方法制备供试品溶液。依法测定，分别在0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时测定。测定吸收值，结果平均值为0.3693，RSD=1.63%。该方法双黄连粉针剂的水溶液，在室温条件下密闭放置6小时，稳定性良好。

2.7 显色稳定性试验

取注射用双黄连（冻干）1002102，精密称定，照2.1.3项下方法制备供试品溶液。依法测定，之后每隔10min测定一次。测定吸收值，结果平均值为0.4853，RSD=1.16%。该方法50分钟内显色稳定性较好。但随时间延长吸收度略有降低趋势，因此建议30分钟内测定完成。

2.8 重复性试验

取注射用双黄连（冻干）1002102，精密称定6份，每份与约10mg，照2.1.3项下方法制备6份供试品溶液。依法测定。测定含量值，结果含量均值为38.725%，RSD=2.42%。由此可见，该方法重复性较好。

2.9 回收率试验

取注射用双黄连（冻干）1002102，精密称定6份，每份与约5mg，同时各精密吸取葡萄糖对照品溶液（相当葡萄糖2.10mg），分别加入上述6个量瓶中，照2.1.3项下方法制备6个供试品溶液。依法进行测定。测定结果见表2。

由此可见，该方法加样回收率较好。

2.10 样品测定

分别依照2.1项下规定的方法进行测定。通过15批（冻干6批、喷干9批）双黄连粉针剂的含量测定，15批粉针的总糖平均含量为37.72%。结果见表3。

3 讨论

（1）张纯等[3]报道经典的硫酸蒽酮法的反应条件100℃下，反应时间10min，测定波长620nm。在采用该法测定牛膝多糖时发现其最大吸收波长并不在620nm处，并时常碰到波峰的漂移情况。引起测定结果的误差。反应温度是导致波峰漂移的主要原因，随着反应温度的升高，最大吸收波长向短波长方向漂移。这可能与温度升高后，糖醛衍生物与蒽酮缩合链增长有关。但笔者研究发现，改良硫酸-蒽酮法（硫酸水合热法）随着加水量减少最大吸收波长向短波长方向漂移。但加水量固定，显色稳定快速。双黄连中的总糖显色也与葡萄糖略有差别，可能是双黄连中含有多种糖的原因。（2）蒽酮法的灵敏度较高需要较少的样品即可达到含量测定的目的，更适合对混合糖的总糖含量测定，双黄连粉针剂中根据研究[4]糖类成分超过20%，其中含量较大的有果糖、葡萄糖、蔗糖（非还原糖），另还含有赤藓醇、鼠李糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、甘露糖、D-半乳糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇等。采用改良硫酸蒽酮法测定双黄连中的总糖应具有可行性。

参考文献

[1]丁礼琴，刘力，徐德生.蒽酮-硫酸法测定生地黄提取物中总糖的含量[J].上海医药，2008，29（8）：368-370.

[2]林炎坤.常用的幾种蒽酮比色定糖法的比较和改进[J].植物生理学通讯，1989，（4）：53-55.

[3]张纯，郭文彪，王雯佶，等.改良硫酸蒽酮比色法测定牛膝多糖的含量[J].中华临床医药杂志，2004，4（19）：17-18.

[4]中国药品生物制品检定所中药与民族药检验检测中心.注射用双黄连（冻干）化学成分研究报告[R].2010年1月，哈药集团中药二厂内部资料.