大鼠急性一氧化碳中毒后c-fos蛋白的表达研究

黄卫巍,陈 阳

（皖南医学院：1法医病理学专业2016级；2法医学院病理教研室，安徽芜湖241002）

一氧化碳中毒是法医学实践中十分常见的死亡原因之一。关于一氧化碳中毒死亡的鉴定主要是依据碳氧血红蛋白致死饱和度、尸体现象(血液及组织呈现樱桃红色）及案发现场的勘察等,然而在实际检案中却经常遇到特征性尸体现象不明显、血液中HbCO远低于致死饱和度（50%以下）等问题，给CO中毒死亡的判定带来一定困难，并引发很多争议[1]。c-fos蛋白属于原癌基因家族，具有即时、快速反应的功能[2]。在正常的生理情况下，c-fos基因及蛋白仅有少量微弱的表达，当脑组织受到一系列的病理或生理的刺激后，c-fos蛋白将大量的表达。已有研究证实了c-fos基因及蛋白在脑挫伤、电流损伤等方面的表达[3-4]，而鲜见有关c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒早期的研究报告。本研究采用静态吸入染毒法建立大鼠急性一氧化碳中毒模型，运用Western blot⁃ting法检测c-fos蛋白在一氧化碳中毒大鼠脑组织中早期的变化规律，免疫组织化学法观察c-fos蛋白的表达部位，以期为法医学推断急性一氧化碳中毒死亡及死亡时间提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠，25只，体重280～300 g(南京青龙山实验动物中心提供）。随机分为急性一氧化碳中毒组及实验对照组，一氧化碳中毒组按中毒后不同时间点分为3 h、6 h、12 h、24 h组，每一时间组5只大鼠，实验对照组5只，共25只大鼠。饲养期间保持空气流通，及时更换垫料，适应性喂养一周，自由饮食，实验前禁食12 h。

1.2 实验材料和试剂

一抗c-fos抗体（ABCam，美国）,内参β-Tubulin抗体(abclona,美国),预染蛋白 Marker(Fermentas，美国),二抗羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、凝胶配制试剂盒(博士德有限公司),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X（博奥森有限公司),RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技术有限公司），即用型SABC-POD试剂盒、增强型DAB显色剂（天根有限公司）。60 L的染毒缸（皖南医学院公共卫生学院提供），99.9%的一氧化碳气体（芜湖市永泰特种气体有限公司），一氧化碳检测管（上海豫东电子科技有限公司）。

1.3 模型制作

中毒组参照Thom SR方法[5]制做大鼠一氧化碳中毒模型并加以改进。将清醒大鼠放入体积为60 L的染毒罐内，然后向罐内注入浓度为99.9%的一氧化碳气体。大鼠在罐内静式吸入3 000～4 000 ppm一氧化碳气体30～40 min。在此期间用一氧化碳快速检测管监测染毒缸内CO气体浓度，使气体浓度保持恒定。实验对照组将大鼠放入染毒缸内30～40 min，不通入一氧化碳气体。

1.4 组织处理

在设定的不同时间点将大鼠断头处死，取左侧大脑经预冷的生理盐水清洗后，迅速放入-80℃冰箱冷冻备用，右侧大脑放入10%的甲醛中进行固定，以用做HE染色及免疫组织化学染色。

取出冻存备用的脑组织加入RIPA裂解液及PMSF经匀浆、离心后，将提取的蛋白用NANOProp 2000检测蛋白浓度确定上样量，加入上样缓冲液将蛋白100℃煮10 min变性，经过SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应后，将胶片进行扫描，测定各组灰度值，计算其与内参β-tubulin的比值以用做统计学分析。

1.5 HE染色

将包埋好的组织蜡块，制成5 μm厚的石蜡切片，在进行常规的脱蜡及水化后采用苏木素-伊红染色制成病理切片，采用光学显微镜观察病理变化。

1.6 免疫组织化学染色

石蜡切片在进行常规的脱水、透明后，用3%过氧化氢封闭非特异性抗原，采用高温高压修复法进行抗原修复（2 000 mL的0.01 moL/L枸橼酸钠缓冲液pH 6.0，高压锅煮沸，放入玻片，待高压锅喷气后计时3 min），c-fos抗体1∶100作为一抗，按照试剂盒提供的说明书进行操作。观察c-fos蛋白的表达部位及强度变化。

1.7 统计学方法

实验中所得数据应用SPSS 13.0进行统计学分析。计量资料用x±s（均数±标准差）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANO⁃VA），两两比较LSD法，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠中毒后表现

大鼠染毒约5 min时出现躁动、兴奋，围染毒缸壁打转，呼吸心跳加快。约15 min时，部分大鼠出现角弓反张、抽搐及聚集现象，后肢肌力明显减退，少动但能对外界的刺激给予反应，尾尖及耳廓呈现樱桃红色。30 min时对外来的刺激无反应，有大小便失禁现象，呈昏迷状态。将大鼠放置通风处逐渐恢复意识。对中毒死亡大鼠进行解剖发现内脏呈樱桃红色且有散在出血点，肝脏充血明显，血液粘稠易凝固。实验对照组大鼠在染毒缸内活动正常，呼吸均匀，解剖未发现明显异常。

2.2 大脑皮质病理学观察

在普通HE染色观察大鼠实验对照组与一氧化碳中毒3 h、6 h、12 h各时间组的组织结构大致相同，脑组织神经元核膜核仁清晰可辨，细胞间隙未见明显水肿。在一氧化碳中毒24 h组中，脑组织轻度水肿，见图1。

图1 两组大鼠脑组织的病理变化（HE染色，×200）

2.3 Western blotting法检测c-fos蛋白的表达情况

与一氧化碳组比较，c-fos蛋白在对照组中表达较少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在一氧化碳中毒各时间组中c-fos蛋白表达水平随着时间的延长呈现一种“双峰”趋势，即3 h明显升高后，6 h略为下降，12 h再次升高达高峰，24 h降低（P＜0.05），见表1，图2。

表1 c-fos蛋白表达灰度值(x± s，n=5）

图2 c-fos蛋白的表达条带

2.4 免疫组织化学法检测c-fos表达情况

c-fos蛋白免疫组织化学染色后呈黄褐色，主要定位于神经细胞胞浆内，胞核中亦见有少量的表达。在实验对照组中大鼠脑组织皮质区内见有少量的c-fos蛋白表达，而在一氧化碳中毒组则呈强阳性表达，见图3。

3 讨 论

一般情况下，一氧化碳中毒是由于吸入汽车废气、木炭、煤块、燃气灶、燃油等不完全燃烧，或者是在火灾等环境下发生的[6-8]。一氧化碳中毒的机制主要是CO进入机体后与血红蛋白结合，形成碳氧血红蛋白（HbCO），碳氧血红蛋白不易解离释放氧气，故造成机体缺氧，其病理特点主要是组织缺氧所致的各种器官功能障碍，重则危及生命。在法医鉴定中，一氧化碳中毒主要依靠检测碳氧血红蛋白的浓度及尸体的特征性征象“樱桃红”来进行判定。由于碳氧血红蛋白浓度受自身疾病、饮酒情况及CO来源的不同影响较大，给鉴定也带来了一定的困难[9-11]。所以寻找敏感可靠的生化指标成为法医学者努力探索的方向。

图3 各组脑组织免疫组织化学染色（SABC法，×400）

c-fos基因是一种参与多种细胞功能的原癌基因，也是即刻早基因家族（immediate early genes,IEG）之一，早在三十多年前就已成为研究脑组织中的早期基因，多项研究表明不同的刺激能诱导c-fos的表达[12]。c-fos基因与c-jun基因编码的蛋白相结合，形成AP-1转录因子，此蛋白可作为第三信使进入细胞核，调节靶基因的转录，从而使外界刺激信号与基因表达偶联，参与一系列的生理或病理活动的调节[13-14]。在正常的人和大鼠的脑组织中，c-fos蛋白表达量较少，当外界的刺激如缺氧缺血作用于大脑时，c-fos基因的表达量就会发生显著且快速的改变[15-17]。

本实验在建立大鼠一氧化碳中毒模型的基础上检测c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒后脑组织中的表达变化。一氧化碳中毒模型的建立主要有三种：静态吸入染毒法、动态吸入染毒法及腹腔注射染毒法。动态吸入染毒法制备模型时吸入浓度稳定且能较好的避免二氧化碳蓄积和缺氧的缺点，但其一氧化碳气体消耗量大且不适宜小型动物的模型制备。腹腔注射法虽能很好地控制气体量，但与正常人体中毒方式不符，且中毒较深[18]。本实验采用静态吸入染毒法制备大鼠一氧化碳中毒模型，采用一氧化碳检测管监测染毒缸内一氧化碳的浓度，且染毒缸较大，可避免染毒过程中的二氧化碳蓄积及氧分压降低对本实验的影响。能使大鼠在正常呼吸的情况下中毒，符合人体中毒方式。

本研究发现在急性一氧化碳中毒后早期脑组织病理学形态改变不明显。在实验对照组c-fos蛋白有少量的表达，可能与处死时的刺激有关。而一氧化碳中毒组c-fos蛋白在脑组织表达迅速增加，3 h表达升高，6 h略为下降，12 h再次升高达高峰，24 h时下降。这可能是当一氧化碳进入机体，神经系统缺氧而应激性上调c-fos蛋白，从而达到对神经系统的保护作用。随着时间的延长，c-fos蛋白逐渐下降，但仍高于对照组。而12 h再次升高，可能是神经系统的复氧损伤所造成，也可能是c-fos蛋白的促凋亡作用引起的继发性损害，有待进一步研究。在本实验过程中还发现大鼠在轻度中毒后，后肢肌力即减退，随着中毒程度的加深，肌力逐渐丧失，这也揭示了在中毒案件中，死者一旦中毒就很难逃离中毒现场，也是其死亡率高的原因。

本研究成功复制了大鼠一氧化碳中毒模型，通过模型研究证实了c-fos蛋白在一氧化碳中毒中的表达与Tang YP的研究结果一致[19]，且发现在一氧化碳中毒后脑组织病理未发生变化之前c-fos蛋白即开始表达并随着时间的延长表现出一定的规律性,对防治一氧化碳中毒迟发性脑病的发病有一定的临床意义。c-fos蛋白表达呈现出较好的即时性以及时间的规律性，为急性一氧化碳中毒的法医学鉴定和中毒时间的推断提供了实验基础。下一步研究重点应着重探讨c-fos蛋白在一氧化碳中毒脑损伤与其他类型的脑损伤在表达部位、强度及发生机制的差异性。

4 结 论

25只实验大鼠随机分为实验对照组及一氧化碳中毒组。Western blotting法检测c-fos蛋白在脑组织的变化规律，免疫组织化学法观察c-fos蛋白的表达部位。结果显示：对照组大鼠脑组织内有少量的c-fos蛋白表达，一氧化碳中毒组在3 h时即可观察到c-fos蛋白的大量表达，6 h略为下降，12 h表达至高峰，之后逐渐下降，呈“双峰”趋势，且与实验对照组相比皆有差异性。提示c-fos蛋白的表达和一氧化碳中毒后经过时间呈现一定的相关性。