MAPK/ERK信号通路在大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的作用及机制研究

陈宾

视神经损伤可明显影响患者视力甚至致盲而严重影响其生存质量[1-2]。小胶质细胞为分布在中枢神经系统内的一类固有免疫效应细胞，在缺血缺氧时一方面可分泌营养因子和吞噬病原体等而对机体起到保护作用，而另一方面亦可通过分泌炎性细胞因子、趋化因子等发挥损伤作用[3-5]。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)是与小胶质细胞密切相关通路，其中ERK1/2通路是其中通路之一[6-7]。因此，明确ERK1/2通路在大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的作用及机制有助于通过对ERK1/2通路进行调控达到控制小胶质细胞活化以及治疗视神经损伤的目的，然而目前关于此方面研究仍较少，需进一步研究证实。因此，本研究通过制作大鼠视神经损伤模型，并探讨ERK1/2通路在大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 100只清洁级健康成年雄性SD大鼠(沈阳医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(辽)2015-0001)，体重160～242 g，平均体重(202.44±20.28)g，所有大鼠均经常规外眼检查和眼底检查确定无相关疾病，喂养在医院实验动物房，喂养条件为干燥、通风、大鼠均可自由摄取食物和水，喂养食物为常规大鼠饲料。将入选的大鼠进行编号并按随机数字表分为实验组50只和对照组50只。

1.2 方法

1.2.1 实验组 采用荧光金双侧上丘逆行标记视网膜神经节细胞并在培养7d后制作视神经损伤模型，在术前3 d每天给予左氧佛沙星滴眼液4滴滴眼，对照组不予处理；实验组均选取右眼制作视神经损伤模型，腹腔注射麻醉后常规进行眼周消毒、开睑、沿角膜边缘剪开，剪断外直肌后拉伸眼球，暴露视神经，在球后视神经2 mm处夹闭损伤后确定视网膜仍可见血流，清洁创口并缝合球结膜，结膜囊内涂抹氧佛沙星眼膏，麻醉苏醒后确认无明显异常后放回原饲养处饲养，术后3 d连续在结膜囊内涂抹氧佛沙星眼膏，完成造模；造模成功后3d取右眼球，分离部分视网膜并将获得的视网膜神经纤维层朝上，常规制作视网膜铺片，并荧光显微镜下观察2组视网膜铺片小胶质细胞存活情况，并采用Image-Pro Plus 6.0软件对视网膜中的小胶质细胞进行计数。

1.2.2 应用蛋白免疫印记法检测2组MAPK通路的ERK蛋白表达水平及磷酸化蛋白水平

将获得的视网膜标本进行液氮速冻后放置在-80 ℃低温冰箱保存待测，检测采用100 g组织加入1 mL细胞裂解液和10 μL的苯甲基磺酰氟的比例提取蛋白质，采用考马斯亮蓝法测定各蛋白相应水平，将组织加热变性后进行电泳，并转移至PVDF膜上采用5%的脱脂牛奶封闭120 min，添加各待测指标一抗以及β-actin并在4 ℃恒温箱中孵育过夜，添加辣根过氧化物标记的各待测指标二抗后在室温下孵育60 min，配置显色液覆盖PVDF膜，1 min后采用Image-lab软件进行目的条带灰度分析，并计算其与β-actin的比值。

1.2.3 应用免疫组化法检测2组视网膜白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等表达水平

将获得的眼球组织常规进行石蜡包埋并切出厚度为5 μm的视网膜连续切片至少3张；将获得的视网膜切片常规进行二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，滴加3%双氧水、滴加EDTA抗原修复液并进行微波修复等措施后滴加IL-10和TNF-α兔抗人多克隆抗体(北京中杉金桥公司提供)，室温孵育60 min后进行DAB染色，显微镜下观察染色满意后以蒸馏水清洗，梯度酒精脱水并采用中性树胶封片观察， IL-10和TNF-α均主要表达于细胞膜或细胞质，以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，检测样本的IL-10和TNF-α阳性率。

1.2.4 向实验组视网膜铺片添加ERK1/2通路阻断剂PD98059，6 h后再次检测其IL-10和TNF-α等表达水平及小胶质细胞存活情况，方法同1.2.1和1.2.3。

2 结 果

2.1 实验组和对照组ERK蛋白表达水平及磷酸化蛋白水平、视网膜铺片小胶质细胞计数、IL-10阳性率和TNF-α阳性率比较

与对照组比较，实验组ERK蛋白表达水平及磷酸化蛋白水平降低，视网膜铺片小胶质细胞计数降低，IL-10阳性率和TNF-α阳性率升高(P<0.05)(表1)。

表1 实验组和对照组ERK蛋白表达水平及磷酸化蛋白水平、视网膜铺片小胶质细胞计数、IL-10阳性率和TNF-α阳性率比较

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 实验组ERK1/2通路阻断剂PD98059阻断前后的视网膜铺片小胶质细胞计数、IL-10阳性率和TNF-α阳性率比较

与阻断前比较，实验组阻断后6h的IL-10和TNF-α等表达水平升高，小胶质细胞计数降低(P<0.05)(表2)。

表2 实验组ERK1/2通路阻断剂PD98059阻断前后的视网膜铺片小胶质细胞计数、IL-10阳性率和TNF-α阳性率比较

注：与阻断前比较，*P<0.05

3 讨 论

外伤、缺血、缺氧、炎症、代谢性疾病、中毒、肿瘤等均可造成中枢神经系统损伤[8-9]。而近年来交通伤、坠落伤、各类炎症反应和代谢疾病以及肿瘤均可导致颅神经损伤，已成为严重影响患者健康乃至生存质量的重要疾病。在颅神经损伤中视神经损伤为其常见类型之一，视神经作为颅神经的一部分，其生理性特殊，其直接和间接性损伤均可影响视力甚至导致眼盲的发生，且其临床治疗困难，无有效治疗手段，疗效欠佳[10-12]。改善视神经损伤治疗效果对改善其患者生存质量具有重要意义。

小胶质细胞为静驻在中枢神经系统内的免疫反应细胞，对中枢神经系统微环境的变化敏感，同时在神经元突触连接以及神经元营养等多个方面具有重要作用，当中枢神经系统稳态环境被打破，小胶质细胞可迅速激活并发生形态的改变，同时可分泌大量促炎因子和毒性因子，亦可分泌营养因子和吞噬病原体等而对机体起到保护作用[13-15]。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)是与小胶质细胞密切相关通路，作为细胞外重要传递介质，可参与小胶质细胞的生长、凋亡、分化、信号传导等，与小胶质细胞功能密切相关[16-18]，而细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路是MAPK三大通路(ERK1/2、应激激活蛋白激酶和氨基末端激酶)之一，可调控细胞生长因子和营养性因子的释放而介导细胞保护作用，但亦可通过控制炎症免疫因子的释放而介导细胞损伤作用[19-20]。因此，ERK1/2通路与视神经损伤的小胶质细胞变化亦可能相关，明确其与大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的关系具有重要意义。

因此，本研究制作大鼠视神经损伤模型，探讨其ERK1/2通路在大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的作用，并分析了其对视网膜白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎症相关因子表达的影响，本研究结果显示相对于无视神经损伤大鼠，存在视神经损伤大鼠的ERK蛋白表达水平及磷酸化蛋白水平降低，视网膜铺片小胶质细胞计数降低，IL-10阳性率和TNF-α阳性率升高，提示ERK、IL-10和TNF-α均可能参与视神经损伤，而视神经损伤可对其小胶质细胞造成明显的影响。向有视神经损伤大鼠的视网膜铺片添加ERK1/2通路阻断剂PD98059进行ERK1/2通路阻断后6 h大鼠的IL-10和TNF-α等表达水平出现升高而小胶质细胞计数降低，提示ERK1/2通路可能通过调控大鼠IL-10和TNF-α等炎症免疫相关因子的表达而参与其神经损伤和小胶质细胞活化调控，从而控制小胶质细胞活化，并可通过ERK1/2通路相关药物达到调控ERK1/2通路，控制小胶质细胞活化以及治疗视神经损伤的目的。本研究均采取了雄性成年大鼠进行实验研究，保证了研究不受年龄以及性别等因素的影响，同时亦导致了研究无法体现雌性视神经损伤大鼠以及不同年龄视神经损伤大鼠的ERK1/2通路状态及其小胶质细胞活化状态，而研究中的相关检测操作亦可能受到检测者操作熟练技术的影响，因此需进一步全面研究克服研究缺陷，确定MAPK/ERK信号通路在大鼠视神经损伤后小胶质细胞活化中的作用及机制。

综上所述，MAPK/ERK信号通路可能通过抑制炎症因子IL-10和TNF-α等表达而减少其视神经损伤并促进小胶质细胞活化，这一机制的发现可能为视神经损伤治疗药物的开发提供方向。