LasI/rhlI基因缺失和阿奇霉素对铜绿假单胞菌毒力基因的影响

鄂顺梅 陈富 龙一飞 林冬玲 蔡壬辛

广州中医药大学第二附属医院检验医学部（广州 510006）

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一种条件致病菌，临床分离率较高，易造成长期反复感染［1］。群体感应系统（quorum sensing，QS）是广泛存在于细菌群体中的依赖细菌密度的信号通讯系统，可调控细菌种群内各种毒力基因的表达，与细菌致病性和耐药性密切相关［2］。PA有3个重要的QS系统：Las系统，Rhl系统和Pqs系统。LasI和rhlI基因分别编码3⁃O⁃C12⁃HSL和 C4⁃HSL两种酰基高丝氨酸内酯（acylhomoserine lactone，AHLs）信号分子，AHLs结合并激活各自的转录激活剂LasR和RhlR，最终调控多种毒力基因的表达［3］。Las系统主要调控外毒素A（exotoxin A）、LasA蛋白酶、碱性蛋白酶（alkaline protease）、外酶（exoen⁃zymes）和弹性蛋白酶（elastase）的合成；Rhl系统可调控鼠李糖脂（rhamnolipid）和磷脂酶（phospholi⁃pase）的合成［4-5］。Pqs系统是PA特有的QS系统，PQS信号分子与其受体PqsR结合后可活化pqs⁃ABCDE和phnAB操纵子的表达，产生更多的PQS信号分子和绿脓菌素［6］。多种毒力因子的释放是PA感染难治性的主要原因，因此抑制QS系统从而调控毒力因子的释放是目前治疗PA感染的主要方向［7-8］。本研究拟通过lasI和rhlI基因的缺失，以及利用QS系统抑制剂阿奇霉素（azithromycin，AZM），观察两者对PA毒力基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂野生型PA菌株由美国罗切斯特大学Barbara H.Iglewski教授馈赠；LasI基因缺失的PA菌株（PA⁃ΔlasI）、RhlI基因缺失的PA菌株（PA⁃ΔrhlI）和两者均缺失的PA菌株（PA⁃Δla⁃sIrhlI）由本实验室构建；RNA提取试剂盒（Promega公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa公司）；荧光定量PCR试剂盒（Thermo Fisher公司）；阿奇霉素（广东省药品检验所）。

1.2 微量肉汤法测定阿奇霉素的MIC值参照CLSI M07⁃A9测定阿奇霉素的MIC值。将100μL倍比稀释后的阿奇霉素药液加入96孔板。挑取PA，PA⁃ΔlasI，PA⁃ΔrhlI和PA⁃ΔlasIrhlI单个菌落接种于3 mL LB培养基中，37℃恒温摇床200 r/min培养至指数生长期。取10μL稀释后的细菌培养物（5×104CFU/孔）接种于含有药液的96孔板中，35℃孵育18～20 h，判读结果。阿奇霉素对4种PA菌株的MIC值为128μg/mL，在本研究中，阿奇霉素处理所有菌株的浓度均为2μg/mL。

1.3 比浊法检测PA的增殖曲线挑取PA，PA⁃Δla⁃sI，PA⁃Δrhl和PA⁃ΔlasIrhl单个菌落接种于3 mL LB培养基中，37℃恒温摇床200 r/min培养过夜。取20μL培养物接种于3 mL LB培养基中，37℃振荡培养，2μg/mL阿奇霉素处理上述培养物，培养2、4、6、8、10、12 h后收集并检测A600吸光度值，绘制增殖曲线。实验重复3次。

1.4 荧光定量PCR（qPCR）检测毒力基因表达改变按照RNA试剂说明书提取PA菌株的总RNA，取1μg RNA经TaKaRa公司PrimeScript RT reagent试剂盒逆转录成cDNA；按照Thermo Fisher公司SYBR Green qPCR Master Mix荧光定量试剂盒说明书进行荧光定量PCR操作，所用引物见表1。采用rpoD基因作为内参基因，通过2⁃△△CT法对所有基因荧光定量PCR数据进行处理，计算出目的基因的相对表达量。

1.5 统计学方法所有实验均进行3次重复。本研究采用SAS 9.2统计软件进行方差分析，计算P值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素对PA菌株增殖的影响如图1所示，野生型PA以及突变体PA⁃ΔlasI，PA⁃ΔrhlI和PA⁃ΔlasIrhlI培养2、4、6、8、10、12 h后，上述4种PA菌株的增殖曲线没有差异（P＞0.05），表明QS系统缺失对PA菌株的生长无显著影响。此外，与无阿奇霉素处理的对照组相比，2μg/mL的阿奇霉素不影响PA菌株的生长（P＞0.05）（图1）。

表1 荧光定量PCR引物列表Tab.1 List of primers for fluorescent quantitative PCR

图1 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素处理后对PA增殖的影响Fig.1 Effect of LasI/rhlIdeletion and azithromycin on the proliferation of pseudomonas aeruginosa.

2.2 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素对Las系统相关基因表达的影响缺失lasI基因（ΔlasI，ΔlasI rhlI）后，lasI表达消失，其下游基因lasA及aprX的表达较野生型明显降低（P＜0.01），而缺失rhlI则无此效应（图2A、2B、2C）。阿奇霉素处理野生型PA后，lasI的表达水平较无阿奇霉素处理组明显减低（P＜0.05）（图2A），而Las系统下游毒力基因lasA/aprX表达则明显升高，但缺失lasI或rhlI后，阿奇霉素对Las系统下游基因lasA/aprX的促进作用减弱甚至消失（图2B、2C）。缺失lasI/rhlI及阿奇霉素处理后toxA的表达均无明显改变（图2D）。

2.3 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素对Rhl系统相关基因表达的影响无阿奇霉素处理组，缺失lasI（ΔlasI，ΔlasIrhlI）后，Rhl系统下游基因rhlA/rhlB的表达较野生型PA显著降低（P＜0.01），但缺失rhlI后，二者的表达下调不显著。阿奇霉素处理野生型PA后，rhlA/rhlB表达上调（P＜0.001），但缺失lasI或rhlI后，阿奇霉素对Rhl系统下游基因的促进作用消失（图3）。

图2 qPCR检测lasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素处理后Las系统相关基因mRNA的表达Fig.2 Fluorescence quantitative PCRwas used to detect the mRNA expression of Las system related genes after lasI/rhlIgene deletion and azithromycin treatment

图3 qPCR检测lasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素处理后Rhl系统相关基因mRNA的表达Fig.3 Fluorescence quantitative PCRwas used to detect the mRNA expression of Rhl system related genes after lasI/rhlIgene deletion and azithromycin treatment

2.4 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素对PQS系统相关基因表达的影响缺失lasI后，phnA/B表达较野生型PA显著下调（P＜0.05，P＜0.01），但缺失RhlI则无此效应。阿奇霉素处理野生型PA后，显著促进phnA/B基因表达（P＜0.001），但缺失lasI后，阿奇霉素对phnA/B表达增强作用不显著甚至消失（图4）。

图4 qPCR检测lasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素处理后PQS系统相关基因mRNA的表达Fig.4 Fluorescence quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of PQSsystem related genes after lasI/rhlI gene deletion and azithromycin treatment

2.5 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素对qscR表达的影响缺失lasI后，qscR表达轻微下调（P＜0.05）。阿奇霉素处理野生型PA后，qscR表达显著上调（P＜0.001），但缺失lasI或rhlI后，阿奇霉素对qscR表达增强较野生型PA明显减弱（图5）。

3 讨论

铜绿假单胞菌QS系统激活后可调节300多个毒力基因，这些基因广泛参与：细菌生长、运动、鞭毛形成、生物被膜形成，以及参与细菌与宿主间的相互作用等关键致病环节［9-10］。铜绿假单胞菌QS系统与细菌致病和宿主逃避等行为密切相关，是临床细菌抗感染研究的热点问题，干扰铜绿假单胞菌的QS系统可有效调节细菌致病性和耐药性。铜绿假单胞菌的QS系统存在级联调节机制：Las系统位于调控网络的顶层，受到刺激信号后最先被启动，使lasI表达上调，同时该系统也可正向调控Rhl系统［11-12］。PQS信号分子的合成同时依赖Las系统的调控，Las系统是PQS的正向调节因子；同时PQS又可以调节rhlI的表达和某些依赖于Rhl系统的基因的表达，从而将这两个系统联系起来［13］。QscR（quorum⁃sensing control repressor）是近年来新发现一个孤儿受体，它不能合成特定的自诱导分子，但是可以通过结合3⁃O⁃C12⁃HSL，C4⁃HSL等信号分子，抑制Las和Rhl系统，QscR活性同时需要Las系统合成的AHL的调节［14］。

本文研究结果显示，在PA生长早期（培养6 h），缺失lasI基因导致毒力相关基因lasA、aprX、rhlA、rhlB、phnA及phnB表达下调，而缺失rhlI基因对上述毒力基因的表达基本无影响，这可能由于Las系统正向调控RhlR，从而弥补了rhlI基因缺失对RhlR激活的缺失。而lasI/rhlI缺失及阿奇霉素处理后toxA的表达无明显改变，可能由于toxA主要在细菌对数生长期末期产生有关［15］。而2μg/mL的阿奇霉素可抑制lasI的表达，但却促进lasI下游毒力相关基因的表达，提示阿奇霉素可能通过不依赖于lasI的机制调控毒力基因表达。而在lasI缺失组，虽然毒力相关基因表达显著下调，但阿奇霉素处理也能在一定程度上促进毒力相关基因的表达，但毒力相关基因总的表达水平比较弱。文中图5结果显示，缺失lasI后，qscR表达下调，推测与Las系统对qscR的表达有一定的正反馈作用有关；在野生型PA中，2μg/mL的阿奇霉素可上调qscR，qscR是Las与Rhl系统的抑制者，这可能是阿奇霉素抑制lasI表达的原因。以上结果提示：PA毒力基因的表达主要还是受QS系统调控；低浓度阿奇霉素可能绕过QS系统而促进毒力相关基因表达，但缺失QS系统仍然能显著抑制阿奇霉素诱导的毒力基因表达。

随着抗生素的广泛使用，PA耐药率逐年上升，给临床治疗带来极大的困难，迫切需要寻找新的抗感染途径。PA是革兰阴性致病菌中QS系统研究的较深入的一种菌种，该ces系统在调节PA诸如毒力因子产生、生物膜形成等与细菌耐药性密切相关的生理现象均起着重要的作用。通过深入研究QS系统，可望阐明细菌耐药性和致病性的关系，解决目前与日俱增的细菌耐药性问题。