初步探讨等量稀释法解决黄疸标本引起的LH750仪白细胞无法分类的问题

陈敬潮 周东铭 连斯敏 张苏伟

[摘要] 目的 探讨血液细胞分析仪无法分类的黄疸标本，通过生理盐水等量稀释后其白细胞分类结果准确性和可靠性。 方法 将无白细胞分类计数结果的黄疸标本与生理盐水等倍稀释后在LH750仪上机进行检测，将稀释后的白细胞分类计数结果与原血液标本在XN-1000血细胞分析仪的计数结果做对比，分析稀释后的黄疸标本的白细胞分类结果与原血液标本白细胞分类是否有差异。 结果 生理盐水稀释的黄疸标本，WBC<2.0×109/L时，相对偏差最小为0%，最大为9.03%；WBC>2.0×109/L时，相对偏差最小为0.09%，最大为5.21%，均符合要求。 结论 生理盐水等量稀释法可用于初步解决黄疸标本白细胞无法分类计数的问题。

[关键词] LH750血细胞分析仪；白细胞五分类；比对试验；高胆红素

[中图分类号] R446.111 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）13-0111-04

Preliminary discussion on using equal dilution to solve the problem that LH750 could not classify white blood cells caused by Jaundice specimen

CHEN Jingchao ZHOU Dongming LIAN Simin ZHANG Suwei

Department of Clinical Laboratory， Shantou Central Hospital in Guangdong Province， Shantou 515041， China

[Abstract] Objective To investigate the accuracy and reliability of white blood cell classifications in normal saline diluted jaundice specimen which could not be classified by blood cell analyzer. Methods Jaundice specimens which not be classified were equally diluted with normal saline and assessed in LH750. Differential count of white blood cells after dilution was compared with the result of original specimen using XN-1000 blood cell analyzer. The white blood cell classifications of diluted jaundice specimen and the original blood sample were analyzed. Results In jaundice specimens diluted by normal saline， when WBC<2.0×109/L， minimum relative deviation was 0% and the maximum was 9.03%. When WBC>2.0×109/L， minimum relative deviation was 0.09% and the maximum was 5.21%. All the results met the requirements. Conclusion Equal dilution of normal saline could preliminarily solve the problem that white blood cells could not be classified in jaundice specimen.

[Key words] LH750 blood cell analyzer； Five classifications of white blood cells； Comparison test； Hyperbilirubinemia

臨床检验中，除去实验室仪器本身性能有一定的局限性，其他非仪器因素包括血液状态、药物浓度等亦会对检验过程形成干扰，导致血液检测出现异常结果。如黄疸标本有时也会干扰血常规中的白细胞分类结果，影响疾病的准确判断等。贝克曼库尔特LH750五分类血细胞分析仪采用V（容量）、C（电导）、S（光散射）的原理[1]，临床检验中大多数的血液标本进行血常规白细胞五分类计数均用此法，快速准确。对于检验过程中出现的黄疸标本，常出现白细胞分类不准确甚至无法分类的情况。出现此异常可能是因为黄疸对光散射造成的干扰，或是胆红素含量过高造成的其他影响。希森美康XN-1000仪采用半导体激光流式细胞技术结合核酸荧光染色技术进行白细胞计数和分类。半导体激光照射在通过鞘流技术处理的细胞上，可根据每个细胞所产生的三种信号来鉴别细胞类别，更大程度上减少其他因素对血细胞分类形成的干扰，包括上述提到的黄疸血液标本中的高胆红素干扰，可准确地对黄疸标本进行白细胞分类计数。本实验拟将LH750仪白细胞无法分类的黄疸标本等量稀释后重新在LH750进行分类计数并评价其白细胞分类结果的可靠性。本文现对2016年11～12月出现的共28例黄疸标本，取500 μL黄疸标本与等量生理盐水混匀后于LH750进行白细胞分类计数，将其结果与原标本在XN-1000仪所得的分类结果进行比较分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本选择

选择2016年11～12月来自我院送检标本中LH750仪无法进行白细胞分类计数，经生化检查总胆红素浓度增高的标本（总胆红素>34.2 μmol/L）：共28例。所有标本均采血2 mL于EDTA-K2抗凝的真空采血管，于2 h内完成标本检测。

1.2 仪器和试剂

贝克曼库尔特LH750血细胞分析仪，专用试剂LH稀释液，Coulter Clenz清洗液，Coulter血细胞分析仪系列溶血剂，Coulter白细胞五分类试剂包（Beckman Coulter实验系统（苏州）有限公司，中国）；希森美康XN-1000血细胞分析仪，专用稀释液：浓缩稀释液DST，稀释液DCL，专用溶血剂与染色液：溶血剂WDF、溶血剂WDF（染色液）、溶血剂WNR、溶血剂WNR（染色液）、稀释液DFL、溶血剂RET（染色液）、溶血剂PLT（染色液）、溶血剂SLS、溶血剂WPC、溶血剂WPC（染色液）（希森美康医用电子（上海）有限公司，中国）；0.9%的生理盐水。

1.3方法

1.3.1 0.9%生理盐水配置 准确称取0.90 g的氯化钠粉末，溶解于少量蒸馏水中，继续稀释至100 mL，摇匀。

1.3.2 验证LH750仪与XN-1000检测结果之间的可比性 根据《WT/T406.-2012 临床血液学检验常规项目分析质量要求》[2]：使用20份临床EDTA-K2抗凝全血样本分别在LH750仪与XN-1000仪两台仪器上严格按照标准操作程序进行双份测定，收集白细胞总数，白细胞五分类百分比，2 h内完成检验。以XN-1000的测定结果为标准，计算相对偏差，其中比对样本的白细胞总数WBC<2.0×109/L，2.0～5.0×109/L，5.0～11.0×109/L，11.1～50.0×109/L，>50.1×109/L的样本数量所占比例应分别达10%、10%、45%、25%、10%。故选择当天实验前2 h内在LH750仪上测得的符合上述白细胞浓度检测要求的临检标本各2、2、9、5、2例，置于两仪器重新进行白细胞五分类计数。根据同实验室两仪器白细胞五分类结果进行比较，差异有无统计学意义（置信区间95%）来表明LH750仪与XN-1000在白细胞分类计数方面的相对偏差是否在临床可接受范围内。

1.3.3 血常规检测 取LH750仪检验过程中出现的白细胞无法分类的黄疸标本，记录总胆红素水平，吸取黄疸全血标本500 μL与等量生理盐水混合后，在LH750仪上重新计数，稀释后的样本不再出现无法分类的情况，散点图异常也恢复了正常图谱，并记录白细胞五分类比例结果。同时将原黄疸标本于希森美康XN-1000仪进行检测，记录白细胞五分类结果。比较两仪器所得五分类百分比的结果，分析稀释后的白细胞分类结果与比对仪器的结果是否存在显著性差异。

1.4 统计学方法

将28例稀释后的标本用LH750仪检测得出白细胞五分类的百分比，与对应标本在XN-1000所检测的的数据进行比较分析：采用SPSS 16.0统计学软件包进行数据处理，采用配对设计资料的Wilcoxon符号秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。将20例全血标本分别在两仪器上所测得的白细胞五分类进行比较，采用线性回归分析两仪器间的可比性：以Sysmex XN-1000血细胞分析仪测定结果为X值，Beckman LH750血细胞分析仪测定结果为Y值，：计算相对偏差（%）表示，相关性用r2表示。相对偏差要求参照《WT/T406.-2012 临床血液学检验常规项目分析质量要求》，r2越接近1，拟合度越高。

2 结果

2.1 LH750儀白细胞无法分类计数的黄疸标本

共28例，标本分布在消化内科、普外一科、普外二科、肾内科，均伴随TBIL增高，其中TBIL<100 μmol/L、100～200 μmol/L、200～300 μmol/L、300 μmol/L以上分别有6、9、4、9例，28例黄疸标本在LH750仪数据结果如下：提示NRBC假性计数，白细胞无分类结果，白细胞总数与XN-1000仪上的结果相比呈现明显增高的趋势，白细胞直方图、散点图图像出现异常。观察白细胞散图分布，左下方有数量不等的红色干扰散点，且随着胆红素浓度增高，干扰散点增多（封三图4～5）。

2.2 LH750仪与XN-1000的比对试验

实验室结果可比性以相对偏差为评价指标，表1结果符合《WT/T406-2012 临床血液学检验常规项目分析质量要求》要求：共对20例血液标本进行检验（表1），每份标本分别使用XN-1000与LH750仪进行检验计数白细胞总数。以XN-1000检测结果为标准，计算相对偏差（要求WBC<2.0时相对偏差小于10.0%，其余相对偏差<7.5%）。实验结果中20例标本计算所得的相对偏差中，WBC<2.0×109/L时，相对偏差最小为0%，最大为9.03%；WBC>2.0×109/L时，相对偏差最小为0.09%，最大为5.21%，均符合要求，表明LH750仪与XN-1000在WBC计数方面的相对偏差在临床可接受范围内，可用XN-1000仪来验证LH750仪的结果。表2是LH750仪所检测得的上述20例标本白细胞五分类结果与对照仪器XN-1000比较，中性粒细胞（Neut.）、淋巴细胞（Lym.）、单核细胞（Mon.）相关性较好，r2分别是0.970、0.969、0.903；嗜酸性粒细胞（Eos.）次之，r2=0.859，嗜碱性粒细胞（Baso.）的r2=0.586，相关性欠佳。故可在接下来用XN-1000仪测得的白细胞分类结果作为此黄疸标本白细胞分类百分比结果，代替无法对黄疸标本进行白细胞分类计数的LH750仪的检测计数，与用生理盐水稀释后的样本白细胞分类百分比结果做比较分析。

2.3 LH750仪与XN-1000五分类结果的差异性验证

稀释后的黄疸标本在LH750仪的五分类结果与原黄疸标本在XN-1000仪检测结果进行比较：将LH750白细胞五分类结果与XN-1000白细胞五分类结果进行整理，因五种白细胞数据均不符合正态分布，用Wilcoxon符号秩和检验，观察Z值（表3），可得Neut、Mon、Lym、EOS、Baso五种白细胞双侧检验P值分别为0.133、0.339、0.933、0.187、0.344，故P>0.05，不可以认为稀释后的五分类比例与真实值存在显著差异。

3讨论

LH750仪利用VCS技术分别检测细胞体积、细胞大小与内部结构和细胞内的颗粒性、核分叶性，其集三种物理学检测技术于一体，在细胞处于自然原始的状态下对其进行多参数分析。LH750仪首先在标本中加入溶血剂直接破裂并溶解红细胞；紧接着加入白细胞稳定剂来中和后红细胞溶解剂的作用，使白细胞表面、胞浆及细胞体积保持不变。然后应用鞘流技术将细胞推进到流动细胞计数池（Flowcell）中，接受仪器VCS三种技术的检测：V、C、S三种探针，在位于流式通道的某一位置，对通过的单列白细胞进行逐个的、同时的、三重的检测，速度快、精密度高、稳定性好，能快速准确对临床上大量的血常规标本进行检测。与手工镜检法相比，黄疸、血脂等因素会直接干扰LH750仪以VCS为原理的分类计数分析，导致白细胞分类计数结果出现异常[3-4]。

高胆红素标本可干扰LH750仪的白细胞分类计数，有学者研究表明，这是因为患者所服用药物或者因疾病所致的自身生理变化可能会使细胞表面所带电荷发生变化，影响了计数过程中白细胞稳定剂所起的作用，阻止了白细胞从肿胀状态快速恢復到原正常形态，发生变化的细胞形态与体积导致仪器无法正确判断，表现为白细胞分布散点图异常，出现Imm.NE1、Imm.NE2及NRBC等假阳性报警[5]。另外，LH750仪在细胞分类计数过程中，血浆成分中存在的高胆红素会对一部分的红细胞溶血剂进行吸收，导致剩余不足量的溶血剂无法将红细胞完全溶解，红细胞或红细胞碎片存在残留[6]。原理上LH750仪是根据细胞大小和细胞结构对细胞进行分类和计数，因此在测定中仪器会误将这些残余红细胞或红细胞碎片划分为白细胞或其他异常细胞，导致结果失常，无法分类。这可以解释在实验过程中出现的黄疸标本白细胞总数与XN-1000仪相比增高的情况。总胆红素显著上升的标本中，留意明显异常的白细胞分布散点图：当总胆红素>200 μmol/L时，在白细胞分类散点图左下方的红色干扰散点区域范围扩大，数量增多。在临床检验上对于黄疸标本无法计数的问题，有文献显示，一种方法是通过洗涤血细胞后重新进行检测的方式（样本经1 500 r/min离心 5 min，吸取上层血浆，并补充同等量的生理盐水）[7]；第二种方法是将标本置于不同检测原理的血细胞分析仪上检测，得出较可靠结果。本实验在第二方法的前提下加以改进，以XN-1000仪结果为基准，标本通过生理盐水等量稀释后在LH750仪上检测，解决白细胞无法分类计数的问题。

本实验主要思路是用生理盐水按1∶1比例稀释高胆红素标本，来减少高胆红素对LH750仪进行白细胞分类计数的干扰，初步探讨等量稀释法能否解决黄疸标本引起的LH750仪白细胞无法分类的问题。本实验中对选取的28例高胆红素标本，分别将500 μL的血液直接与等量生理盐水混匀后于LH750仪检测，可发现与原来无法分类白细胞相比，LH750仪可直接分类计数稀释后的黄疸标本，得出白细胞五分类结果，白细胞直方图、散点图图像正常，白细胞散点图左下方干扰散点明显减少，同时通过比较分析得出此白细胞五分类百分比结果与原血液标本在XN-1000仪检测结果并无显著差异。本实验表明，高浓度的胆红素可对以VCS为原理的LH750血细胞分析仪检测过程产生干扰，影响血细胞分析仪对各类血细胞的分类判断，导致分类结果异常，最终仪器提示白细胞无法分类，所以将高胆红素血液标本用生理盐水对倍稀释，降低高胆红素浓度对作用于血细胞的红细胞溶血剂和白细胞稳定剂的影响，同时还可减少一定浓度的胆红素产生的颜色干扰，实为一种方便可行的消除影响的方法[8]。

在临床检验中也发现，对于生化结果TBIL>34.2 μmol/L的黄疸标本，LH750仪可对部分标本进行准确的白细胞分类，甚至一些标本TBIL>200 μmol/L，也可得到血常规白细胞分类结果。猜测有可能黄疸只是其中一个次要因素，主要因素可能是标本血浆内其他某个因素导致的或者综合因素导致的结果，而等量稀释后可以降低这个影响。

将LH750仪所检测的上述20例标本白细胞五分类结果与对照仪器XN-1000比较（r2值），二者在Baso的分类结果相关性欠佳（r2<0.5）。出现上述现象的主要原因可能与被测标本外周血中Baso数量少（正常范围0～1%），且LH750仪结果有效数字为0.1，故而在结果的表示上及后续计算中存在较大概论的随机误差。一些研究结果表明，采用相对偏差（%）或者相关系数（r），通过嗜碱性粒细胞的计数结果来比较分析两仪器的分类情况可比性，出现相对较大的相对偏差、较差的相关性[9-12]。故仅通过计算相对偏差、相关系数来进行评价不同仪器分类结果可比性也并不合适[13]。

本实验数据少，标本只选取了两个月内符合要求的28例标本，此结论有待进一步扩大样本数据范围再进行更深入的讨论。本实验将稀释后的标本在LH750仪测得的结果与原标本在XN-1000仪所测结果比较来判断稀释后的血常规结果可靠性，但更为可靠的是执行金标准[14，15]：将白细胞不分类的高胆红素标本进行手工镜检，严格执行白细胞异常分类的复检标准所得的，进而判断盐水稀释的白细胞分类结果是否准确，有待进一步的实验研究。

综上所述，LH750仪对非黄疸患者全血的白细胞分类结果准确，但当标本本身出现黄疸时，用LH750仪所得结果有时会出现无法分类的情况，因此，LH750仪白细胞分类也只能对大多数标本进行一个快速准确的血常规检验，当出现其他异常细胞，白细胞直方图、散点图异常，白细胞不分类的特殊标本情况时，应进行手工镜检，并结合临床诊断情况，以免漏诊、误诊。

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（收稿日期：2018-02-26）