炭疽芽胞杆菌nprR突变株的生物学特性分析

袁利思，陶好霞，江巍，关清，王博文，刘纯杰，刘东，王艳春

1.河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

炭疽芽胞杆菌是一种高致病性的革兰阳性 细菌，其主要的毒力因子包括由毒性大质粒pXO1编码的致死因子和水肿因子，以及由毒性大质粒pXO2编码的炭疽荚膜。在感染的早期阶段，细菌在荚膜的保护下逃过免疫吞噬，并通过炭疽毒素杀死免疫细胞。感染后期，大量细菌分散到全身血液中，产生大量毒素，在不同的器官中发挥毒性作用，最终导致宿主死亡[1-2]。炭疽杆菌在机体内扩散过程中，炭疽自身表达的Npr599和InhA等蛋白酶发挥了十分重要的作用，协同炭疽毒素破坏宿主的表皮屏障和血脑屏障，引发中枢神经系统感染，进而发生炭疽型脑膜炎，是一类关键的毒力相关因子[3-5]。

炭疽杆菌的中性蛋白酶调控因子（neutral protease regulator，NprR）是 Rap/NprR/PlcR/PrgX（RNPP）转录调节因子大家族的成员，其主要功能是调控炭疽芽胞杆菌Npr599等胞外蛋白酶的表达[6]。研究表明，平板上培养的炭疽杆菌在37℃连续培养6 d后会发生自发突变，产生一系列突变菌株，其中大部分蛋白酶活性降低的突变株的nprR基因内部发生了不同形式的突变，突变的NprR蛋白不再发挥中性蛋白酶调控因子的作用，结果导致菌株胞外蛋白酶活性降低[7]。另外，全基因组测序结果表明，用于炭疽上清吸附疫苗生产的低蛋白酶活性的炭疽芽胞杆菌V770-NP1-R（ATCC 14185）株同样也在nprR基因座（GBAA0597）上发生了缺失突变，并推测这可能是该菌株蛋白酶活性低的重要原因[8]。

在前期研究中，我们利用反向选择系统构建了在nprR基因5′端缺失的突变型炭疽芽胞杆菌A16RΔnprR，本研究继续对该菌株的生物学特性进行系统鉴定和分析，以深入了解nprR基因缺失突变对菌株的影响，为进一步利用该菌株进行炭疽疫苗抗原的表达与制备奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

减毒炭疽芽胞杆菌 A16R（pXO1+，pXO2-）、A16RΔnprR::Erm、A16RΔnprR和 A16RΔnpr599均为本研究室保存菌株。因减毒炭疽芽胞杆菌A16R株属于危害程度第三类微生物，本研究涉及减毒炭疽芽胞杆菌的实验具体操作过程在二级生物安全柜中进行，含菌废弃物全部经严格灭菌处理。

2×EsTaq mix为北京康为世纪公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒为北京天根生化公司产品；HRP酶标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物科技有限公司；碳水化合物鉴定试剂条API 50 CH及CHB/E培养基为法国bioMerieux公司产品；鼠源保护性抗原（protective antigen，PA）单抗及兔源Npr599多抗血清为本实验室自制；脑心浸液（BHI）培养基和脱脂奶粉为BD公司产品；蛋白胨和酵母提取物为OXOID公司产品；其他常规化学药品均为国药集团公司产品。

1.2 突变株的PCR鉴定

取A16R、A16RΔnprR::Erm和A16RΔnprR菌株的过夜培养物1.5 mL，提取基因组作为模板进行PCR鉴定。引物设计位置为缺失突变位点的上下游，上游引物为5′-TTGAACGAAAGAGTGCGC ATGTG-3′，下游引物为 5′-TCAAATCTCGATAAA CTGGAAAAATG-3′。PCR 条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30个循环；72℃充分延伸5 min。

1.3 突变株的蛋白酶活性分析

取A16R、A16RΔnprR和A16RΔnpr599不同菌株的过夜培养物3 μL滴到奶粉平板（奶粉平板制备方法：LB固体培养基中添加1%的脱脂奶粉，二者分别高压，使用前混合后倾倒平板）上，待液滴风干后，37℃倒置培养48 h，观察不同时间点平板上蛋白水解圈形成情况，判断菌株胞外蛋白酶活性。

1.4 突变株的Npr599和PA表达分析

取A16R和A16RΔnprR过夜培养物1 mL接种到100 mL LB液体培养基中，37℃培养10 h，4℃离心收集上清，用截留相对分子质量为10 kDa的超滤管超滤浓缩至1/20，取一定体积的浓缩液加入上样缓冲液制备SDS-PAGE样品，进行电泳分析。电泳结束后转膜进行Western印迹分析，将NC膜放入5%的脱脂奶粉中，37℃封闭2 h，用洗涤液PBST洗3次，每次5 min，加入兔抗Npr599多抗血清（1∶10 000）或鼠源抗PA单抗（1∶5000），37℃孵育1 h，用洗涤液PBST洗3次，每次5 min，再加入相应种属特异性二抗（1∶5000）孵育1 h，用洗涤液PBST洗3次，每次5 min，利用凝胶成像系统ECL发光显影，拍照记录结果。

1.5 生长特性分析

1.5.1 生长曲线测定 取A16R和A16RΔnprR过夜培养物4 mL接种到400 mL LB液体培养基中，37℃、250 r/min培养，每小时测定D600nm值，平行进行3次重复实验，绘制A16R和A16RΔnprR株的生长曲线。二者差异分析应用Graphpad 5.0统计分析软件进行，对生长曲线的结果比较采用重复测量资料的方差分析进行处理。

1.5.2 芽胞形成能力分析 取A16R和A16RΔnprR过夜培养物1 mL接种到100 mL LB液体培养基中，37℃、250 r/min培养96 h以上，取一定量的菌体进行芽胞染色，对比观察2种培养物的生长状态及芽胞形成情况。

1.6 突变株糖代谢分析

活化A16R和A16RΔnprR菌株，挑取数个菌落溶于1 mL无菌生理盐水中，吸取溶有菌体的生理盐水，滴入5 mL无菌生理盐水，混匀，制成浊度相当于2 McFarland的均一菌悬液，记录滴入滴数，将2倍体积的菌液滴入10 mL API 50CH B/E培养基中，然后将此培养基滴入API 50CH生化试剂条中，避免产生气泡，并保持管内厌氧环境，覆上盖，置37℃培养箱中培养，24 h后拍照记录结果。

2 结果

2.1 PCR分析

以细菌基因组DNA为模板，对目标基因片段进行扩增。如图1所示，A16R的扩增结果约为700 bp，A16RΔnprR::Erm的扩增结果为2.8 kb，而A16RΔnprR的扩增结果约为400 bp，与A16R相差说明突变株中nprR基因部分缺失。

图1 突变株的PCR检测

2.2 蛋白酶活性分析

利用奶粉平板进行菌株蛋白酶活性分析，结果如图2所示，培养24 h后，对照菌A16R菌斑周围存在明显的水解圈，但突变株A16RΔnprR周围则没有明显的水解圈，这与另一株作为对照的蛋白酶基因缺失株A16RΔnpr599基本一致；继续培养至48 h后，A16RΔnpr599株也出现微弱的水解圈，而A16RΔnprR株依然没有水解圈出现，说明其蛋白酶水平极低。

图2 突变株的胞外蛋白酶活性检测

2.3 中性蛋白酶Npr599和保护性抗原表达分析

炭疽杆菌中性蛋白酶Npr599是受NprR调控的蛋白之一，因此我们检测了突变株中该蛋白的表达情况。Western印迹实验表明，与出发株A16R相比，突变株中Npr599蛋白几乎不再表达（图3A）。另外，以保护性抗原的单克隆抗体作为一抗的Western印迹实验结果显示，突变株中PA的降解明显减少，PA表达水平得到提高（图3B）。

图3 突变株的Western印迹

2.4 生长特性分析

对比突变株A16RΔnprR和A16R的生长曲线发现，在相同培养条件下，突变株A16RΔnprR的D600nm值与A16R基本一致，说明二者生长速率相当，经统计方差分析2种菌的生长性能差异不显著（P＞0.05）。

将培养96 h的重组菌株进行芽胞染色。在实验条件下，突变株A16RΔnprR形成芽胞的能力与对照A16R相比明显下降，如图5所示，同样培养条件下的A16R菌株绝大部分以芽胞形式存在，而突变株A16RΔnprR只有很少一部分形成芽胞，主要以繁殖体形式存在，说明敲除nprR基因影响了菌株形成芽胞的能力。

图4 菌株A16R和A16RΔnprR的生长曲线

图5 菌株A16R和A16RΔnprR的芽胞形成能力

2.5 突变株糖代谢分析

糖代谢分析结果表明，突变株A16RΔnprR组与A16R组的试剂条颜色变化情况相同，说明2种菌株对49种碳水化合物的代谢情况一致，突变株的生化特性较出发株A16R没有明显变化（图6）。

图6 菌株A16R和A16RΔnprR的糖代谢分析

3 讨论

以减毒炭疽杆菌作为炭疽疫苗相关抗原表达宿主或者构建减毒活疫苗，一直是炭疽疫苗研究的一个方向[9-11]。但是由于炭疽杆菌自身表达众多的蛋白酶，目标蛋白容易被水解，因此如何改造相关菌株，提高目标抗原表达就成了一个关键问题。有研究者利用同源重组技术，构建缺失6个蛋白酶的突变株BH460，免疫印迹分析显示该菌株PA、致死因子（LF）和水肿因子（EF）的表达都明显提高，特别是EF表达水平比以往文献中报道的都高，且具有良好的生物学活性[12]。但上述方法对菌株经过多次遗传改造，容易影响菌株的生物学特性。我们的研究表明，炭疽杆菌的中性蛋白酶调控因子基因nprR缺失突变后，菌株蛋白酶活性的降低就十分明显，在奶粉平板上几乎没有水解圈形成，这对于其作为一种宿主菌表达和制备炭疽疫苗相关抗原具有重要意义，可以大幅度减少相关蛋白的降解。这一点也与我们实验中炭疽保护性抗原表达的检测结果一致，突变株PA降解现象明显比A16R株减弱，PA表达水平有所提高，突变株更利于PA的制备。

另外，对与炭疽杆菌同属的苏云金芽胞杆菌的研究表明，NprR蛋白作为一种转录激活因子，通过与Spo0F这一芽胞形成相关蛋白相互作用，促进芽胞形成，当nprR基因缺失后，菌株形成芽胞的能力受到影响[13-14]。我们在炭疽杆菌中也发现了类似结果。与出发株A16R相比，A16RΔnprR株形成芽胞的能力明显受到影响，从显微镜观察结果来看，培养96 h后，处于游离状态的芽胞极少，而同样条件下培养的A16R株则几乎全部形成芽胞，繁殖体极少。由于突变株在LB培养基中几乎丧失了芽胞形成能力，同样利于其作为宿主菌表达和制备PA等炭疽疫苗相关抗原。

总之，炭疽杆菌突变株A16RΔnprR具有极低的胞外蛋白酶活性，不容易形成芽胞，是炭疽疫苗相关抗原表达和制备的较为理想的宿主菌。