组织切片多光谱定量分析技术在肿瘤免疫学研究中的应用

熊芮，范昌发，王佑春

中国食品药品检定研究院 实验动物资源研究所，北京 100050

随着现代组织学分析技术的发展，仅仅测量匀浆组织中分子的平均表达量已不能满足研究人员的需求，在保持细胞和组织结构特征的同时，得到检测目标详尽的空间分布信息以及精确可靠的定量结果在研究中变得越来越重要。使用传统方法，在福尔马林固定石蜡包埋组织切片上对多个目标信号共定位，在实验操作上十分具有挑战性。组织切片多光谱定量分析技术的高分辨率与高灵敏度，克服了传统分子成像技术的不足，为免疫细胞表型分析、定位和定量提供了新思路，被广泛用于肿瘤免疫学研究。

1 组织切片多光谱定量分析技术的原理

组织切片多光谱定量分析技术是近几年建立起来的一种新技术[1]，与流式细胞术类似，它能够定量评估细胞表型及活性，还可以同时提供组织背景和相关细胞与细胞相互作用的信息，而这些信息难以或不可能通过其他方法获得[2]，故该技术在生命科学、医学研究中有其独到用途。该技术包括三个部分：①多重免疫荧光标记，可通过独有的抗原直标和抗体去除技术，并借助酪酰胺信号放大（tyramide signal amplification，TSA）的作用[3]实现在同一切片上进行多重免疫荧光染色（标记原理如图1），在同一张完整的组织切片中同时清晰成像和进行数据分析的免疫荧光标记可多达7个。②多光谱成像（multispectral imaging，MSI）与光谱拆分算法（图2），组织自发荧光和相互重叠的颜色信号会严重干扰实验结果，光谱拆分技术能够拆分发射峰相近的荧光标记信号[4]，多光谱成像技术可将颜色信号以连续光谱的方式记录，得到经修正的单通道图像，最后为光谱拆分后的单通道图像添加伪彩，重新生成多通道图像。与普通的RGB成像相比，多光谱成像能够识别细微的颜色差异，在解决信号间串色干扰问题的同时去除自发荧光背景。③定量组织切片图像分析软件，通过软件的内置组织类型识别算法，使系统自动定位目标组织区域，获得精确至单细胞乃至细胞器水平的多参数定量结果，对组织形态和结构信息进行完整而全面的评价。

2 组织切片多光谱定量分析技术的优势

多标记流式细胞术（flow cytometry，FCM）广泛用于定量检测血液中游离免疫细胞的特定亚群数量，但不能揭示实体瘤内部和周围的免疫细胞的空间关系和功能状态，而这其中可能包含了预测患者对特定免疫疗法的反应所需的重要信息。免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）无法捕获分析免疫细胞亚群所需的复杂多标记物表型，同时对3个以上标记物进行可视化或定量研究。石蜡切片的自发荧光现象会降低免疫荧光（immunofluorescence，IF）的灵敏度和定量可靠性[5]，由于显色信号重叠，又会导致成像困难。

图1 多重免疫荧光标记原理

图2 多光谱拆分示意图

多光谱成像克服了上述检测手段的不足，大幅降低了福尔马林固定石蜡包埋组织自体荧光的影响[5]。该技术将多标志物染色、多光谱成像和软件定量算法分析汇聚结合[6]，支持石蜡切片中确定复杂的细胞表型、原位检测免疫细胞和评估检查点表达，同时对单个细胞上多种标记物进行定量计算，自动识别组织形态，分割不同的组织区域（如肿瘤和基质），获得以前方法无法企及的信息。

3 组织切片多光谱定量分析技术在肿瘤诊断及评价预后中的应用

与传统解剖病理学不同，多数研究人员希望在组织切片水平上获得关于细胞蛋白表达的信息，以实现精确的定量分析[7]，包括目的细胞百分比计数、组织面积测量、标记物显色强度或荧光强度的测量。如利用经典IHC方法对淋巴瘤进行免疫分型时，有经验的血液病理学家可凭染色强度评分，虽具有临床价值，但数据主观性强，重复性有限[8]。由于没有直观的细胞定量数据，难以建立更加精确的诊断标准。Ng等[9]将多光谱定量分析技术用于血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（angioimmunoblastic T-cell lymphoma，ATIL）的研究，用多重免疫荧光法标记TFH标志物（BCL6和PD1），经定量组织切片图像分析软件分析直接精确得出ATIL患者组织切片的CD4+细胞中BCL6阳性细胞和PD1阳性细胞的百分比，及2种标志物同时表达的细胞百分比，经多光谱定量分析软件处理，将细胞表型分析结果图形化，可精确诊断和判断ATIL的预后。Chris[10]等将MSI与自动组织细胞识别软件结合，准确定量Rab-B肝中Ki-67+增殖的肝细胞。图像分析软件自动学习组织细胞的形态，对其形态学进行评估，将组织图像划分为不同区域的能力可以极大地帮助病理学家判断与鉴别复制的组织形态，减少人为错误[11]。

4 组织切片多光谱定量分析技术在肿瘤发生机制研究中的应用

肿瘤微环境在肿瘤细胞的远距离转移中发挥重要作用。Mlecnik等[12]利用多光谱成像技术及其图像处理软件，并结合组织芯片，分析原发性结直肠癌（carcinomaofcolon and rectum，CRC）患者肿瘤组织中血管、淋巴管及肿瘤内浸润的淋巴细胞密度。他们用多荧光标记法在组织芯片上对CRC患者组织的血管和淋巴管标志物及多个免疫靶点（CD3/CD4/T-Bet/CD45RO/CD8/GZMB/CD57等）进行标记，依靠多光谱定量分析软件自动将血管、淋巴管与其他组织区分，并由软件直接计算血管面积/组织面积、淋巴管面积/组织面积的比率，不仅降低了组织芯片使用的成本，还提高了研究人员的分析效率，减少人为主观判读偏差。

Zaretsky等[13]利用多光谱定量分析技术研究接受抗PD-1（programmed death-1）疗法的黑色素瘤患者复发的肿瘤细胞免疫逃逸机制，通过定量分析，可更加清楚及方便地分析出患者黑色素瘤样本中 PD-L1（programmed death-ligand 1）的表达水平和细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）浸润的水平和空间位置关系，在探索获得性抵抗PD-1阻断疗法的机制中起到重要作用。

Nghiem等[14]用多重免疫荧光技术处理一位Ⅳ期Merkel细胞癌患者治疗前后的活检标本，以评价潘利珠单抗（Pembrolizumab）的治疗效果。此方法避免多次切片，克服了多个免疫标志物不能在同一张切片上同时显色的问题，得到背景干净、信号清晰的数据图片。治疗前结果显示在肿瘤-基质界面处免疫浸润最强烈，只有边缘的肿瘤细胞为PD-L1阳性，仅靠近CD8+T细胞的肿瘤细胞才表达PD-L1。流式细胞术无法获得这种复杂的位置信息。经过抗体治疗后，活检标本显示有弥漫性免疫吞噬细胞浸润，无残余的肿瘤细胞，并计算出阳性细胞比例。利用该结果，可遴选更适于免疫抗体治疗的病人，提高抗体药的疗效。

在一项包含18种类型癌症的研究中[15]，Huang等用多重荧光标记术标记了MET/HGF通路中的蛋白质，推导出MET癌蛋白激活的模型。Stefanie等用抗-OX40与抗-CTLA-4和HER2疫苗联合治疗荷瘤小鼠[16]，他们用MSI技术发现联合治疗后肿瘤部位出现强烈的肿瘤破坏效应，伴有效应T细胞浸润肿瘤组织，证明联合免疫疗法能够逆转T细胞失能，提高小鼠存活率。Woods[17]等在炎症和非炎症状态下，研究黑色素瘤细胞对逃逸T淋巴细胞杀伤作用的机制，利用多光谱定量分析技术同时得到明场和荧光图像，在黑色素瘤活检标本中显示免疫蛋白酶体（immunoproteasome，IP）亚基和CD3+细胞的分布情况，发现二者的表达有明显的相关性，并且在整个组织中免疫蛋白酶体的表达不均匀。

5 组织切片多光谱定量分析技术在其他疾病方面的应用

在传染性疾病方面，多光谱成像技术已被用于原位共定位检测细胞因子与病毒。如丙型肝炎和隐匿性丙型肝炎病毒感染是一种与肝细胞癌和淋巴增生性疾病发病风险增加有关的病理类型，利用MSI可以证明丙型肝炎病毒是否促进淋巴细胞生长、侵入细胞免疫细胞并在细胞中传播[18]。MSI也可与FISH结合，用于研究隐匿性乙型肝炎病毒感染如何诱导外周血淋巴细胞中可见的DNA损伤[19]，以及用于确定人类肿瘤中的溶瘤呼肠孤病毒的分布情况[20]。除此之外，组织切片多光谱定量分析技术在神经科学研究[21]、移植研究[22]、心血管疾病研究中[23]也有所涉及。

6 结语

组织切片多光谱定量分析技术解决了长期阻碍实验的技术难题：在明场图像下，分割组织区域或细胞区室，支持多重染色单独定量分析；在荧光图像下，目标荧光与组织自发荧光得到有效区分，解决石蜡组织切片自发荧光干扰实验的问题。总之，基于多光谱成像与组织切片图像分析软件相结合的组织切片多光谱定量分析技术是目前较新的组织原位细胞表型分析技术，将在生命科学基础研究、肿瘤临床诊断等方面发挥积极作用。最近国内外也有少数科学家将该技术用于病毒学、病毒感染机制研究中。