奥曲肽对TGF-β1诱导大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响*

2018-08-29 03:26赵旭文刘春涛
中国应用生理学杂志 2018年3期
关键词:奥曲生长抑素高糖

赵旭文, 刘春涛

(1. 阆中市人民医院呼吸内科, 四川 南充 637400; 2. 四川大学华西医院呼吸内科, 成都 610041)

慢性气道炎症与气道重构是支气管哮喘的两大病理特征。气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)增殖肥大是哮喘气道重构的重要组成部分之一,多种生长因子、细胞因子、炎性介质参与ASMCs增殖的调节。其中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是导致ASMCs增生的重要生长因子。生长抑素及其衍生物是具有广泛抑制细胞分泌和增生活性的神经肽,其对肿瘤细胞及ASMCs等多种细胞增生的抑制作用已得到证实。生长抑素及其衍生物通过其受体(somatostatin receptors,SSTRs)发挥作用,含有SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)是多种细胞中介导SSTR2增生抑制信号传导的重要分子[1]。奥曲肽(octreotide)是一个八肽的生长抑素衍生物,可作用于SSTR2、3、5,已被临床上广泛用于治疗消化道出血、胰腺炎、消化道肿瘤等。选择性SSTR2激动剂L-779976能抑制气道平滑肌细胞增生。本实验拟探讨生长抑素衍生物奥曲肽对TGF-β1诱导ASMCs增殖的抑制作用及其诱导凋亡的作用,并了解上述作用是否通过SHP-1介导,为探索预防哮喘气道重构新的干预措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠由四川大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器

TGF-β1购自美国Peprotech公司。奥曲肽为北京诺华制药有限公司产品。SHP-1(酪氨酸536磷酸化)抗体购自英国Abcam公司。SHP-1抑制剂NSC87877购自英国Tocris公司。MTT购自美国Sigma公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。流式细胞仪ESP型(Coulter,美国)。

1.3 大鼠气道平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

脊椎脱臼法处死大鼠,75%酒精浸泡2 min,无菌分离气管,去除内外膜,剪成1 mm3大小的组织块,均匀铺在培养瓶上,加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养液,于37 ℃、5% CO2条件下培养,待细胞融合至单层用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶2传代培养,自然纯化,2~3 d换液1次,实验用第3~6代细胞。培养的ASMCs经免疫荧光细胞化学方法鉴定平滑肌细胞特有的α-肌动蛋白。

1.4 MTT比色法测定ASMCs增殖

取对数生长期ASMCs以1×104cells/well接种于96孔培养板内常规培养。细胞密度达60%时,换用含2%FBS的培养基继续培养24 h,使细胞同步化于G0期。照以下分组处理细胞:(1)对照组:2%FBS+DMEM高糖;(2)TGF-β1组:10 ng/ml TGF-β1+2%FBS+DMEM高糖;(3)奥曲肽组:0.1 nmol/ml 奥曲肽+10 ng/ml TGF-β1+2%FBS+DMEM高糖;(4):NSC87877组:50 μmol/l NSC87877+0.1 nmol/ml奥曲肽+10 ng/ml TGF-β1+2%FBS+DMEM高糖。加入NSC87877 2 h后加入奥曲肽,再隔2 h后加入TGF-β1,各组设4个复孔。继续培养48 h后,每孔加入MTT(5 g/L)20 μl,37℃、5% CO2孵箱内孵育4 h。弃培养液,加入DMSO 150 μl振荡10 min,用酶联免疫检测仪测定490 nm波长各孔吸光度值(A490 nm值)。

1.5 Annexin V/P I双标记流式细胞仪分析法检测ASMCs凋亡

取培养3~5代对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化后以5×105cells/well细胞密度接种于6孔板,置37℃、5% CO2培养箱培养。细胞密度接近80%时,分为以下3组:对照组:10%FBS+DMEM高糖;0.01 nmol/ml奥曲肽组:0.01 nmol/ml奥曲肽+10%FBS+DMEM高糖;0.1 nmol/ml奥曲肽组:0.1 nmol/ml奥曲肽+10%FBS+DMEM高糖,每组设4个复孔。继续培养24 h,以0.25%胰蛋白酶液消化,收集细胞,制成细胞悬液,按Annexin V-FITC试剂盒说明书操作步骤处理细胞,用流式细胞仪检测凋亡率。

1.6 Western blot检测磷酸化SHP-1水平

将ASMCs以5×105cells/well的细胞密度接种于六孔板中,在37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞密度达80%~90%时,分组同MTT比色法,每组设3个复孔。加入NSC87877 20 min后加入奥曲肽,再隔15 min后加入TGF-β1,继续培养15 min收集细胞提取蛋白。方法如下:(1)每孔加入200 μl细胞裂解液(已加入蛋白酶抑制剂),冰上裂解20 min,用细胞刮收集于EP管中;(2)超声(200 w) 3 s,2次。4 ℃,12 000 r/min 离心2 min。取上清分装,于-70 ℃保存备用。另取小份以BCA法作蛋白质定量。(3)分别配置10%的分离胶和4%的浓缩胶,取蛋白样品40 μg,加入5×SDS上样Buffer,混匀后98 ℃变性3 min,用SDS-PAGE 160 V电压下分离蛋白样品。(4) 转膜后取下凝胶,浸泡在转移缓冲液中平衡10 min。PVDF膜先用纯甲醇浸泡饱和15~30 s。组装电转移装置,100 V电转2.5 h。(5)电转结束后将膜置于TBS中漂洗,封闭1 h,加入抗SHP-1一抗(1∶1 000)4 ℃过夜。TBST缓冲液洗3次,每次5 min。加入二抗(1∶5 000)孵育1 h。(6)TBST缓冲液洗3次,每次5 min,ECL显色。凝胶成像分析系统分析蛋白质条带。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 奥曲肽对TGF-β1诱导大鼠ASMCs增殖的影响

TGF-β1组ASMCs的增殖反应显著高于对照组(P<0.01) ,TGF-β1+奥曲肽组ASMCs增殖反应低于TGF-β1组,与TGF-β1组比较有显著性差异(P<0.05),TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组的增殖反应进一步降低,与TGF-β1+奥曲肽组比较有显著性差异(P<0.01,表1)。

GroupCell proliferationControl0.978±0.049TGF-β11.081±0.036**TGF-β1+octreotide1.013±0.026#TGF-β1+octreotide+NSC878770.910±0.014△△

ASMCs: Airway smooth muscle cells; TGF-β1: Transforming growth factor-β1

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsTGF-β1+octreotide group

2.2 奥曲肽对ASMCs凋亡的影响

0.01 nmol/ml奥曲肽组ASMCs早期凋亡率高于对照组(P<0.01),而0.1 nmol/ml奥曲肽组与对照组比较凋亡率无显著差异(表2,图1)。

GroupRatio of apoptosis(%)Control0.86±0.090.01 nmol/ml octreotide3.47±0.60**0.1 nmol/ml octreotide0.74±0.11

**P<0.01vscontrol group

Fig.1ASMCs apoptosis in early stage

A: Control group; B: 0.01 nmol/ml octreotide group; C: 0.1 nmol/ml octreotide group

2.3 奥曲肽对SHP-1(Tyr536磷酸化)水平的影响

SHP-1蛋白质与β-actin蛋白质的灰度相对值数据显示:TGF-β1组较对照组p-SHP-1水平显著降低(P<0.05);TGF-β1+奥曲肽组较TGF-β1组p-SHP-1水平升高,但差异无统计学意义;TGF-β1+奥曲肽+NSC87877组p-SHP-1水平较其余3组显著降低(P<0.01,表3,图2)。

Groupp-SHP-1Control38.40±3.20TGF-β129.33±4.77*TGF-β1+octreotide29.77±3.39TGF-β1+octreotide+NSC8787715.47±1.58**##△△

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group;△△P<0.01vsTGF-β1+octreotide group

Fig.2p-SHP-1 level of ASMCs in four groups determinated by Western blot

A: Control group; B: TGF-β1 group; C: TGF-β1+octreotide group; D: TGF-β1+octreotide+NSC87877 group

3 讨论

支气管哮喘是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等多种细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾患。气道平滑肌细胞不仅在炎性介质的作用下被动收缩引起气道狭窄,亦可能通过旁分泌或自分泌主动地参与炎症反应与气道重构。气道平滑肌细胞增生是气道重构重要组成部分之一。

炎性介质、细胞因子、生长因子与气道重构的发生密切相关。体内和体外实验证实,TGF-β1是促进气道平滑肌增生和气道重构的重要因子之一[2-4]。奥曲肽是一个八肽的生长抑素衍生物,可作用于SSTR2、3、5[5],有抑制增生和促进细胞凋亡等作用,不仅可抑制神经内分泌肿瘤细胞增生,对乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌等实体肿瘤的生长也有抑制作用[6]。奥曲肽能否通过SSTR2等受体抑制TGF-β所致ASMCs增殖尚未见报道。本研究用MTT方法发现,TGF-β1+奥曲肽组ASMCs增殖反应低于TGF-β1组,说明奥曲肽能抑制TGF-β1所致ASMCs增殖。Blake的研究证实,选择性SSTR2受体激动剂能够抑制ASMCs增生[7],本研究结果与之相似。TGF-β1 刺激ASMCs增殖是哮喘气道重构的重要事件,本研究发现奥曲肽能抑制TGF-β1 所致ASMCs增殖,提示此类药物具有预防气道重构的潜能。

在哮喘发病机制当中,不仅存在炎性细胞的凋亡不足或延迟,也存在气道结构细胞如ASMCs的过度增殖和凋亡不足。细胞凋亡是一种凋亡相关基因共同调控的自身程序化死亡,是细胞有序而协调激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同调控的过程。奥曲肽与SSTR3结合,通过激活细胞内酸性核酸内切酶、诱导p53和Bax生成,引起肿瘤细胞凋亡[8]。本研究通过Annexin V-FITC/PI双标法检测奥曲肽诱导的ASMCs凋亡,发现0.01 nmol/ml奥曲肽组ASMCs早期凋亡率与对照组相比差异有统计学意义,而0.1 nmol/ml奥曲肽组与对照组比较凋亡率无显著差异。这与Lemaire等研究放线菌酮对B淋巴细胞凋亡的影响结果相似,通过对caspase-3的不同影响,高剂量和低剂量对凋亡产生完全相反的作用[9]。细胞的种类特异性,不同剂量对某一凋亡相关基因相反调节,或者不同剂量时凋亡刺激基因和凋亡抑制基因间的此消彼长,可能解释奥曲肽对ASMCs凋亡的双向调节。为了使对细胞生长达到最大的抑制,下一步研究应寻求奥曲肽对增生、凋亡综合作用的最佳时间和浓度。

SHP-1激活是SSTR2介导抗增生效应信号传导的重要步骤,因此用免疫印迹检测了磷酸化SHP-1的水平。结果显示,TGF-β1+奥曲肽组较TGF-β1组SHP-1水平稍升高,但差异无统计学意义。推测除了SHP-1激活这一重要机制以外,SSTR2介导的抗增生效应还可以通过其他途径来实现。SSTR2的抗增生效应也可能通过减少周期素D1,导致G2/M期延迟[10]。在胰腺癌细胞中,SSTR2介导内源性连接蛋白26(connexin 26,Cx26)和连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达增多形成功能性间隙连接,从而使细胞过密性抑制得到修复[11]。Blake的研究证实受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶激活以及细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular-signal regulated kinase1/2,ERK1/2) 抑制是选择性SSTR2激动剂抑制ASMCs增生的机制之一[7]。综上所述,奥曲肽抑制ASMCs增生与SHP-1激活无关,推测可能通过SSTR2上调Cx26、Cx43、RPTPs或下调周期素D1、ERK表达,或通过SSTR3、SSTR5介导,从而抑制ASMCs过度生长。

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