补骨脂对牙周炎大鼠牙移动保持期OPG表达的影响

宋春蕾 赵刚 王明明 宋佳

【摘要】 目的：观察牙周炎大鼠牙移动保持期间，采取灌胃补骨脂水煎液对牙周组织中OPG表达情况。方法：按照随机数字表法将45只建立牙周炎的雄性大鼠分为三组，每组15只。空白对照组：建立牙移动模型后处死。实验组和阴性对照组：牙移动模型建立后去除拉簧，安放保持装置，各保持3、7、14、21 d。实验组在保持期内灌胃补骨脂水煎液，阴性对照组灌服等量生理盐水。制作免疫组化切片，观察上颌第一磨牙远中侧牙周组织OPG的表达情况。结果：阴性对照组在早期变化不显著，3 d后不断增加，实验组在整个保持阶段OPG的表达呈不断增加的趋势。在同一时段进行对比，实验组OPG的表达均明显大于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：补骨脂水煎液可提高牙周炎大鼠牙移动后牙周OPG的表达，加快牙周改建。

【关键词】 補骨脂； 牙周炎； 牙移动； 保持； OPG

【Abstract】 Objective：To observe the expression of OPG in periodontal tissues during the retention period after tooth movement in the rats with periodontitis.Method：According to random number table method，45 male rats with established periodontitis were divided into 3 groups，15 rats in each group.The blank control group：rats were sacrificed after the establishment of tooth movement model.The experimental group and the negative control group：after the establishment of tooth movement model，the reed spring was removed，the retainer were maintained 3，7，14，21 days.The experimental group was orally administered with Psoralen Water Decoction during the retention period，the negative control group was given the same amount of Normal Saline.Immunohistochemical section was made to observe the expression of OPG in the distal periodontal tissue of maxillary first molar.Result：In the negative control group，the change was not significantly at the early stage and increased continuously after 3 days，the expression of OPG increased continuously in the experimental group showed an increasing trend during the whole retention period.The OPG expression at all time points of the experimental groups were significantly higher than that in the negative control group（P<0.05）.Conclusion： Psoralea Water Decoction can improve the expression of OPG in periodontal tissue of rats with periodontitis during the retention period after tooth movement and accelerate the repair of periodontal tissue.

【Key words】 Psoralea Corylifolia Linn； Periodontitis； Tooth movement； Retention； Osteoprotegerin

First-authors address：Oral Medicine College Jiamusi University，Jiamusi 154000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.008

随着经济社会的发展，人们对于美观的要求不断提高，存在错颌畸形症状的成人正畸患者数量逐年增加，其中多数患者伴有不同程度的牙周疾病。由于牙周炎会导致牙周支持组织的病损，正畸主动治疗后牙周组织的恢复与适应将需要更长的时间。如何将中药应用于正畸领域，近年来逐渐引起研究人员的关注。中草药补骨脂（Psoralea Corylifolia Linn）为豆科类植被，味辛、苦，大温，无毒，有补肾行气、缩尿止带、健脾止泻的功效[1]。现代药理学研究表明其不仅具有雌激素样作用，还具有促进骨形成和抑制骨吸收的作用[2]。同时补骨脂因其药效，对预防骨质疏松症也有作用[3-5]。由成骨类细胞分泌的OPG（Osteoprotegerin），能抑制破骨细胞（Osteoclast，OC）形成和激活，减少牙槽骨破骨性的吸收。本文实验拟通过将补骨脂水煎液应用在牙周炎大鼠牙移动保持期，观察OPG表达变化，研究补骨脂在炎性牙周改建过程中的作用，为牙周炎患者正畸后缩短保持时间提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 每1 000 mL水中加100 g补骨脂干燥果实（购自陕西，经黑龙江中医药大学中药研究所鉴定符合2015版《中国药典》补骨脂质量控制标准）浸泡30 min，加热至沸腾半个小时后滤渣，将滤液浓缩至100 mL，即制成100%浓度的水煎剂，备用（含1 g生药/mL）。DAB显色剂、兔抗多克隆一抗（武汉博士德生物工程有限公司），二抗PV6001（北京中杉金桥生物科技有限公司）。

1.2 实验动物 选用8周龄健康雄性Wistar大鼠50只[购于佳木斯大学动物实验中心，许可证号：SCXK（黑）2013-001]，体重（220±20）g，适应环境1周后开始实验，最终纳入45只。

1.3 方法

1.3.1 分组 按照随机数字表法将45只建立牙周炎的大鼠分为3大组，每组15只，共9小组。空白对照组：将建立牙周炎后的大鼠牙移动21 d后处死。阴性对照组和实验组：各4小组（每一保持时间点设置1小组），牙周炎大鼠牙移动21 d后去除加力拉簧，在上颌左侧第一磨牙与前牙间安放保持器，分别保持3、7、14、21 d，于保持前1 d以补骨脂水煎液开始灌胃实验组大鼠，剂量为5.6 g/kg（约5.6 mL），1次/d，直到处死。无菌生理盐水等量灌胃阴性对照组大鼠。

1.3.2 动物实验模型的建立

1.3.2.1 建立大鼠牙周炎模型 以10%水合氯醛（佳木斯大学口腔医院药房提供）腹腔注射大鼠（3.5 mL/kg），动物安静后仰卧于操作台，拴牢头部和四肢，用自制开口器暴露视野，使用快速手机在大鼠双侧第一磨牙颈部颊腭方向靠近龈缘的地方制备一0.2 mm深固位沟，用0.2 mm结扎丝（正畸用型号）分别围着大鼠第一磨牙颈部一圈实施结扎，在腭方结扎并将结扎头尽量埋入龈沟里，待大鼠清醒后饲以高糖饮食4周。每天检查，如有损坏丢失及时重置。

1.3.2.2 建立大鼠牙移动模型 参照林鹏等[6]的方法，在大鼠上颌两颗前牙的唇舌面以及远中侧距离龈缘约0.5 mm处用快速手机磨出约0.2 mm的深沟。用0.2 mm正畸钢丝穿入镍钛拉簧后，一端通过前两颗磨牙之间于腭侧结扎，另一端嵌入中切牙固位沟内，用测力计测量，对第一磨牙向近中施加约50 g力后唇侧结扎，并用玻璃离子固定，连续牵拉21 d后去除拉簧。每天检查口内装置，如有损毁丢失应及时重置。

1.3.2.3 建立牙移动后保持模型 牵引21 d后去除大鼠口内装置，以上颌左侧牙弓作为保持侧，在左侧第一磨牙与中切牙间，使用0.25 mm正畸钢丝安放保持装置，右侧不保持。分别保持3、7、14、21 d，每一时间点处死5只，保持期间每天检查口内装置，如有脱落及时补救[7]。

1.3.3 免疫组化 以过量水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉处死，解剖取出含磨牙区的上颌骨，修剪后固定于4%多聚甲醛液（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，编号：AR-0211）24 h。之后浸泡于10%EDTA液（广州行知生物科技有限公司，编号：AAPR16-500）中于4 ℃脱钙约50 d，PBS冲洗干净组织块后石蜡包埋。以平行牙体长轴，从腭侧向颊侧的方向进行切片，获取近远中方向切片，选择断面为完整牙周韧带进行观察。OPG表达量以平均光密度（OD值）代表，每例牙根远中侧随机分析3个不同的高倍镜视野，取其平均值，该值越大，代表OPG表达越强。

1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。采取多因素方差方法分析比较时间和药物因素对OPG表达量的影响，LSD多重检验方法对各组内不同时间段OPG表达量分析对比，P<0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 观察免疫组化切片 OPG以淡黄色、浅棕色粒状为主呈现于胞浆和胞质中，上颌第一磨牙远中侧牙周组织中都有OPG表达，且在牙槽骨表层的骨细胞以及牙周膜细胞中都可见不同程度的阳性表现。

2.2 大鼠正畸牙远中侧牙周OPG免疫组化分析统计 药物和时间因素对牙周炎大鼠正畸牙远中侧牙周OPG表达的影响，差异均有统计学意义（P<0.05）。阴性对照组OPG的表达在早期变化不显著，3 d随后不断递增，而实验组在整个保持阶段呈不断递增的趋势。两组在同一时段进行比较，在3、7、14、21 d比较，实验组远中侧OPG的表达均明显大于阴性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

3 讨论

牙周炎（chronicperiodontitis，CP）是一種由紧贴在牙根表面的菌斑生物膜引起的，呈现出慢性炎症反应的疾病。其主要临床特征是牙槽骨、牙周膜等牙周支持组织的破坏[8]。牙周炎患者正畸治疗后，牙周组织修复要比正常患者需要更长的时间，才能使移动后的牙齿稳固在新的位置上。为防止复发，有些牙周病损严重的患者需要长期甚至一生佩戴物理保持装置。当前许多国内外研究证明采用药物可以控制牙齿的移动，降低正畸后牙齿的复发，此类药物包括西药，如辛伐他汀（Simvastatin）、二磷酸盐等[9-10]。而中草药从古至今被我国人们广泛使用，相对于西药，中药不容易产生耐药性，药效温和，毒副作用小等这些特点，使中药的开发和利用逐渐得到国内外研究人员的关注，如淫羊藿、黄芩苷、川芎嗪等[11-13]。目前许多研究发现补骨脂活性成分能直接或间接的影响成骨相关因子的表达，加快成骨细胞（osteoblast，OB）增殖，或者通过上调OPG表达量，减缓OC的形成，间接地影响骨的代谢[14]。近年来，通过不断探索补骨脂对牙周炎的影响发现，补骨脂能发挥雌激素样作用，减缓牙槽骨的吸收，加快OB的增殖，增加牙槽骨密度，促进了受损牙周组织的重建[15]。此外，补骨脂还具有明显的抗炎性，可抑制炎性细胞分泌的各种黏附因子和细胞因子的释放[16]。

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）亦名OC生成抑制因子，经分子克隆技术发现的一种与骨密度调节有关的分泌性糖蛋白，是TNF超家族的一种受体。OPG可作为诱饵与RANK竞争性的结合RANKL，导致与OC表面受体RANK相结合的RANKL数量的减少，抑制了OC的增殖分化及成熟，使OC的生成量相对降低，减缓了骨的吸收[17]。OPG在口腔中遍布较为广泛，牙周支持组织均可以测到OPG的表达[18]。因此，OPG可以作为衡量骨改建活跃程度的一个指标。牙周炎可打破骨代谢的均衡，导致牙周骨组织吸收。动物实验研究表明，OPG是牙周炎的重要调节因子，其参与牙周炎骨组织吸收活动。钟雯怡等[19]将重组人骨保护素（rhOPG）局部注射于牙周炎大鼠磨牙牙周袋间隙，发现牙周炎大鼠牙槽骨中OPG表达量明显提高，RANKL的表达量降低，这可能是改变了受损牙牙周骨组织重建过程中OPG/RANKL的平衡，使成骨大于破骨，有助于牙周炎患者受损牙周骨组织的修复。

通过动物实验研究，以补骨脂水煎液剂量为5.6 g/kg（约5.6 mL）给予大鼠灌胃，结果发现补骨脂可以抑制OB和骨髓基质细胞RANKL表达，增加OPG表达量，表明中药补骨脂可加快成骨作用[20]。本文以此为依据，实验研究发现，实验组牙周炎大鼠随着用药时间的增加，OPG表达水平逐渐提高；在同一时间段组间比较，使用传统结扎丝进行物理保持的对照组牙周炎大鼠，其OPG表达水平均低于实验组，说明在大鼠正畸牙保持期间，通过灌胃给予补骨脂水煎液能够促进牙周炎大鼠牙周组织中OPG蛋白的表达，这有助于加快成骨细胞的成骨活动，增加牙槽骨的骨量，从而使移动后的牙齿能够更早地稳固在新的位置。

本实验采用的补骨脂使用广泛，并具有促骨形成作用的中药，将其应用到牙周炎患者正畸治疗后牙齿的保持阶段，与传统物理保持相配合下，该中药能够缩短牙周炎患者正畸治疗后牙齿的保持时间，使正畸治疗后的效果得到巩固和维持，降低复发的可能性，使正畸患者接受正畸治疗的整个时间得到缩短。目前随着对中药补骨脂的深入研究，其包含的众多有效成分被不断开发和利用，相信在口腔正畸领域也将会有巨大的应用价值。

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