UFLC-MS/MS法检测羊肉汤中罂粟成分

杨崇俊，曲筱静，李 强，高中勇

（济宁市公安局刑事科学技术研究所，山东 济宁272000）

食品中滥用罂粟壳会给食品安全带来严重隐患[1]。罂粟壳主要含有吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀等成瘾性生物碱成分，长期食用会对人体造成危害[2]，因此国家将罂粟壳列入违禁品予以管制，禁止非法供应、运输和使用。但一些不法分子为了经济利益将其加入到食品中，严重危害人们的健康。

羊肉汤料中的组分十分复杂，而目前对食品中吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀等罂粟成分的检测如薄层色谱法[3-4]、液相色谱法[5]、气质联用法[6]和液质联用法[7-8]等，均由于操作繁复且灵敏度不高，不适于羊肉汤的检测。经参考文献资料和实验，本文建立了超快速液相色谱串联质谱方法，检测羊肉汤中吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀等罂粟成分，为鉴别是否使用罂粟壳提供了借鉴手段。

1 材料与方法

1.1 试剂

吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀标准品，购自公安部物证鉴定中心。

标准溶液配制：取吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀标准品10 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释，配置成1 mg/mL储备标准液；再以甲醇溶解并稀释，配成10 μg/mL工作液，4 ℃冰箱冷藏储存。工作液在使用前由储备液稀释而成。

碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH=9.0）。

乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、乙腈均是色谱纯，其余试剂是分析纯。

1.2 仪器

美国API4000Qtrp LC-MS/MS，ESI离子源；岛津LC-20A高效液相色谱仪；低温高速离心机（8000 r/min ,10 min）；电子天平；涡旋机；高速振荡机；氮吹仪。

1.2.1 质谱条件

AB三重四级杆串联质谱（API4000Q）采用电喷雾模式（ESI+），操作参数：碰撞气（CAD）：Midium；气帘气（CUR）：25；离子喷射电压（IS）：5500；雾化温度（TEM）：500 ℃；GS1：55；GS2：55；筛选分析毒物母离子、子离子，优化最佳碰撞电压（CE）和去簇电压（DP），MRM检测，离子驻留时间为50 ms，总循环时间为0.44 s。

1.2.2 色谱条件

岛津20A液相，液相柱为岛津Shim-packXRODS（3.0 mm×75 mm，2.2 mm），流动相为缓冲液和甲醇，缓冲液为5.0 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液，流速0.5 mL/min，柱温40 ℃，进样量为5 μL，10%有机相开始，流动相程序见表1。

表1 流动相程序Table 1 The setup and parameters of the mobile phase

1.3 样品前处理

取5 mL羊肉汤样品，加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液1 mL，涡旋振荡，加入乙酸乙酯-异丙醇混合液（3:1）5 mL，振荡10 min，离心（8000 r/min，10 min) ，取上清液，重复再提取一次，氮气吹干（40 ℃），用500 μL甲醇溶解，-18 ℃冷冻2 min，离心（8000 r/min，2 min)，上清液过0.22 μm有机膜，用流动相稀释10倍，进样分析。

2 结果与讨论

2.1 方法特异性

取对比羊汤空白样品5 mL，按上述方法检测，结果与标样图谱比较，未检出吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀的特征质谱峰，说明该方法特异性良好。

2.2 方法检测限

取吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因标准工作液添加到空白羊肉汤中，在以上UFLC条件和MRM条件下检测，以S/N≥3为标准进行检测，检测结果：羊肉汤样品中吗啡含量0.2 ng/mL，S/N=3.6；可待因含量为1.0 ng/mL，S/N=4.1；罂粟碱含量0.05 ng/mL，S/N=3.5；蒂巴因浓度为0.5 ng/mL，S/N=3.1；那可汀浓度为0.1 ng/mL，S/N=4.2。

2.3 方法的基质效应和回收率

取吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀标准工作液，分别添加到空白羊汤中，配制成10、50、100 ng/mL 3种浓度的羊汤；各取3份，处理后对应浓度标准工作液进行比较，用含有羊汤基质的工作液与标准工作液比为基质效应（ME），添加到羊汤中的与含有羊汤基质的工作液比为回收率（RE）。结果显示，按照本方法处理，基质干扰小，回收率高，均在80%～110%之间，见表2。

表2 羊汤中三种浓度吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因加标回收率测定Table 2 The matrix effect and recoveries of drugs spiked in mutton soup

2.4 方法优化

2.4.1 前处理优化

罂粟壳中有效成分为吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀等，萃取溶剂采用复合溶剂，既有弱极性的乙酸乙酯，又有强极性的正丙醇，保证了目标物不遗漏。吗啡含有两性基团，只有pH在7.6～9.0时，吗啡才呈现最好分子游离状态，故采用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液调整pH值。

本方法针对复杂食品基质检测，羊汤成分油脂含量高，吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因等含量低，必须经有效除油脂才能检测，采用-18 ℃冷冻除油脂，方法简单易行，效果良好。直接用甲醇溶解浓缩物，甲醇对罂粟成分有较好的溶解，又可沉淀蛋白，去除蛋白的基质效应，能为质谱检测减少基质干扰。

2.4.2 质谱条件优化

采用0.5 μg/mL的标准品溶液做质谱图，采用ESI正离子模式，通过调整CE、DP电压，测得吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因的特征碎片，通过多次反复实验，它们的碎片稳定性良好。实验结果见表3。

表3 MRM定性检测离子Table 3 Qualitative detection of ions by MRM mode

多离子监测模式（MRM）能最大限度排除各种杂质干扰，而且对于液相色谱分离条件要求较低，化学性质相似的同系化合物即便不能完全分离，采用MRM方法，也能进行准确的定性定量检验。

2.4.3 色谱条件优化

由于吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀在C18色谱柱上保留特性不一致，在流动相的选择过程中，比较了不同梯度的甲醇-水体系和乙腈-水体系，前者的分离效果及柱效明显好于后者，为了增强分离效果及提高质谱中的离子化效率，选择甲醇-水体系作为流动相。

本实验采用梯度洗脱方法（表1），通过实验优化，各目标物的保留时间分别为 1.61、1.79、1.91、1.97、1.99 min，整个方法用时仅5 min，同时用三倍体积的流动相通过色谱柱，保证了色谱柱的稳定性，结果证明该方法准确高效。

3 案例应用

2015年3月，某市食品药品监督管理局对某家经营羊肉汤的餐馆检查，怀疑有添加罂粟壳的非法行为，送检羊汤样本到我中心检验。经采用本方法检测，在所送羊肉汤中检出了吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀等成分，见图1。

图1 羊肉汤中毒品色谱图Fig.1 Chromatograms of drugs in the detected mutton soup

综上所述，采用复合有机溶剂萃取，低温除脂，应用UFLC色谱法分离，MS/MS选用MRM模式能够成功检测出羊出肉汤中微量吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀等罂粟成分，方法回收率在80%～110%之间，检出限在1.0 ng/mL以下。实验和实践证明，本方法适应于实际案件的检验分析。