Survivin在不同TNM分期肝细胞癌组织中的表达及意义

党存曙，王 涵，刘大鹏，刘志春，边 佺

(1.中国石油天然气集团公司中心医院，河北 廊坊 065000；2.天津医院，天津 300211)

原发性肝癌多起病隐匿，预后较差，是目前世界上癌症相关死亡的第二大恶性肿瘤[1]。据统计，全球每年新发原发性肝癌约748 300例，死亡695 900例，新发与死亡病例中的50%以上发生在中国[2]。肝细胞癌是肝癌中最主要的病理类型，生存率极低。生存素(Survivin)是近年发现的抑制蛋白家族新成员，可抑制细胞凋亡，具有调节细胞有丝分裂、促进肿瘤血管生长等功能，密切影响着肿瘤的分化及增殖[3]。研究发现，Survivin在结肠癌[4]、甲状腺癌[5]、肺癌[6]等多种肿瘤中异常表达，在肝癌组织及外周血中的表达也有报道[7]。本研究通过检测Survivin在不同TNM分期原发性肝癌组织、癌旁组织中的表达情况，探讨了其与肝细胞癌分期的关系，旨在为肝细胞癌的化学诊断提供更多参考依据。

1 临床资料

1.1组织标本来源 收集2011年9月—2016年12月于中国石油天然气集团公司中心医院行肝癌手术切除且病理分型为肝细胞癌的40例患者癌组织及其对应的癌旁组织标本，其中男31例，女9例；年龄33～70(51.42±8.33)岁；TNM临床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期4例；患者术前均未进行放化疗等抗肿瘤治疗，癌旁组织为癌灶旁2～3 cm的肝脏组织，部分标本为肝硬化组织。另取同期因肝脏损伤手术或肝血管瘤手术切除的10例患者正常肝组织标本作为对照，其中男8例，女2例；年龄32～69(51.45±8.38)岁。

1.2试剂及仪器 一抗Survivin兔抗人单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自美国罗氏公司。

1.3研究方法 采用免疫组织化学法检测Survivin在各期癌组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达。

1.3.1组织标本切片制作 术后组织标本经含4%多聚甲醛的磷酸缓冲盐(PBS)溶液灌流，于4 ℃下固定2h后，放入同温度下4%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脱钙，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后常规石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.3.2免疫组化染色 常规烤片、脱蜡至水、室温冷却，PBS封闭15 min，山羊血清封闭15 min，一抗(Survivin 浓度为1∶100)4 ℃冰箱孵育过夜，次日PBS冲洗，滴加二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色、复染、脱水、透明、干燥封片。以PBS代替一抗作阴性对照，光学显微镜下观察、计数并摄片。

1.4结果判定标准 所有切片由2名经验丰富的病理科医师进行评价，意见不一致时协商统一。①阳性细胞计分标准：随机选取每张切片的5个高倍视野观察，Survivin表达于肝细胞的胞核及胞浆，以阳性细胞表达数≤5%计0分，5%<阳性表达细胞数≤25%计1分，25%<阳性细胞数≤50%计2分，50%<阳性表达细胞数≤75%计3分，阳性表达细胞数>75%计4分。②染色强度计分：细胞不着色计0分，细胞着色为浅黄色计1分，细胞着中黄色或棕色且无背景着色计2分，细胞着深棕色或棕褐色且无背景着色计3分。③依据两项计分数值相乘结果判断切片染色的阳性等级：0～1分为阴性，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性()，9～12分为强阳性()。切片阳性表达率(%)=阳性(弱阳性+阳性+强阳性)表达例数/总例数×100%。

1.5统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析数据。计数资料以例(%)表示，率的比较采用2检验，趋势检验应用趋势2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Survivin在肝细胞癌组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达情况 Survivin在正常肝组织中未见表达(见图1)；在癌旁组织表达较少(见图2)，阳性表达率为27.5%(11/40)；在肝细胞癌组织中大量表达(见图3)，阳性表达率为80.0%(32/40)。Survivin在肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织及癌旁组织(P均<0.05)。

图1 Survivin在正常肝组织的表达(DAB，×100)

图2 Survivin在癌旁组织的表达(DAB，×100)

图3 Survivin在肝细胞癌组织的表达(DAB，×100)

2.2Survivin在不同TNM分期肝细胞癌组织中的表达情况 Survivin在不同TNM分期肝细胞癌组织中均有阳性表达，见图4～7；且随着TNM分期的增加，Survivin阳性表达率呈逐渐增高的趋势(P<0.05)，见表1。

图4 Survivin在TNMⅠ期癌组织中的表达(DAB，×100)

2.3Survivin在不同TNM分期肝细胞癌对应癌旁组织中的表达情况 Survivin在不同TNM分期肝细胞癌癌旁组织中的阳性表达率随分期的增加呈增高的趋势(P<0.05)。见表2。

图5 Survivin在TNMⅡ期癌组织中的表达(DAB，×100)

图6 Survivin在TNM Ⅲ期癌组织中的表达(DAB，×100)

图7 Survivin在TNM Ⅳ期癌组织中的表达(DAB，×100)

表1 Survivin在不同TNM分期肝细胞癌组织中表达情况 例(%)

表2 Survivin在不同TNM分期肝细胞癌对应癌旁组织中的表达情况 例(%)

3 讨 论

原发性肝癌的发病率较高，其较低的早期确诊率多使患者失去手术机会，而高复发转移率大大降低了患者生存率[8]。目前原发性肝癌化学诊断的主要检测指标是血清肿瘤标志物，其中甲胎蛋白(AFP)是广泛应用的血清蛋白质肿瘤标志物之一，但因其灵敏度较低，在一些非肿瘤性肝病、生殖系统和胃肠道恶性肿瘤中也经常会异常升高，因此亟待发现新型的肿瘤标记物。

Survivin基因定位于染色体17q25，编码产生一个分子质量为16.5 ku的结构独特蛋白，表达在癌细胞中的胞浆及细胞核。Survivin仅有BIR结构域而无锌指结构是其与抑制蛋白家族中其他蛋白的不同之处，其是目前发现的作用最强的凋亡抑制蛋白[9]。研究发现，Survivin致病机制可能与其调节PI3K/AKT通路，直接抑制凋亡酶(caspase)发挥抗凋亡作用，上调血管内皮生长因子(VEGF)表达，参与肿瘤血管形成等有关[10]，这些机制有效抑制了肿瘤细胞的凋亡，在肿瘤扩散、浸润、发展过程中起到举足轻重的作用。近年来研究发现肿瘤患者的生存率随Survivin的高表达有降低趋势，并且与化疗抵抗、肿瘤复发和肿瘤患者生存期有关，因而该蛋白成为肿瘤分子靶向治疗的目标之一[11]。

本研究结果发现，Survivin蛋白在肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织及正常肝组织，且阳性表达率有随肝癌TNM分期增加上升的趋势，与Jin等[12]研究结果一致。原发性肝癌是原癌基因激活、抑癌基因受抑制、凋亡过程受阻等多因素共同作用所致，由此推测随着肝癌的恶化，Survivin在癌组织中的表达逐渐增多，放大凋亡抑制作用，促进肿瘤恶化及扩散。另外Survivin在癌旁组织中的阳性表达率虽然明显低于癌组织，但其阳性表达率也有随着肿瘤分期的升高而有增高的趋势，且Ⅳ期肝癌的癌旁组织中有明显阳性()表达，或许表明虽然癌旁组织暂未发现异型性的肿瘤细胞，但颇具肿瘤特征的凋亡抑制改变已经产生,促进了肿瘤组织的局部扩散，癌旁组织的细胞功能特性已明显不同于正常组织。Morinaga等[13]的研究表明，正常肝组织中Survivin有少量表达，而本研究中正常肝组织中未见Survivin表达，可能与这部分组织标本数量较少及手术取材部位选择的偶然性有关。

综上所述，Survivin在肝细胞癌组织中有大量表达，且随肿瘤TNM分期的增加，其在癌组织及癌旁组织中的阳性表达率有增高的趋势，为研究Survivin在肝细胞癌化学诊断方面应用的可能性提供了理论基础及依据。