付国斌
中国科学院神经科学研究所 比较神经心理学研究组,上海 200031;中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心,上海 200031
中国有句俗语:龙生龙,凤生凤,老鼠的儿子会打洞。虽然以前并没有遗传学,但这句话确实很好地体现了遗传的稳定性。遗传中的可变性同样可以用一句俗语体现:龙生九子,各有不同。在遗传上,这种稳定中带有一定可变性的特征主要源自有性生殖,也就是子代的基因来自于父母双方。例如:人的绝大部分基因在46条染色体上,父母双方各贡献23条。相对于有性生殖,如果龙生九子采用无性生殖,那结果将是九子的基因都来自于同一条龙,只需要母亲,而且可能只需要一次生育,简单高效。但是,高等动物一般采用有性生殖,无性生殖在细菌、植物和低等动物中才普遍存在。造物主和其他生物对简单高效有什么样的态度是个未知数,但人类显而易见是这种模式的忠实粉丝。生物学在最近百年来的进展使人类能够将无性生殖应用在本是有性生殖的动物上,并有一个专门的词汇:克隆(clone)。那么这个被人们广泛熟知的生物学专业词汇到底是什么含义?何时又为何能被人们熟知并引起广泛关注?哪些动物已经被克隆?电影中的克隆人距离现实到底还有多远?
与其他很多专业词汇一样,克隆(clone)这个词来源于古希腊单词(klōn),最初是指小嫩枝长成一个植物[1],在20世纪走进生物学,主要指基因的复制,进入21世纪后更是应用广泛,早已超出早期的含义。即便在生物学内,克隆的意义也各有不同:在分子生物上主要是指DNA的复制,在细胞学上指培养一群同基因组的细胞,在动物学上指获得同基因组的生物个体[2]。本文主要讨论动物克隆。
地球上早期出现的生命普遍采用有性繁殖,也是克隆的一种形式,而有性繁殖则出现的较晚,为什么是这样呢?因为无性繁殖相对简单和高效。例如:最常见的大肠杆菌可以直接通过DNA的复制和细胞分裂,产生2个大肠杆菌,而且只要条件合适,只需要15 min即可分裂一次。这意味着一个大肠杆菌在经过一天的繁殖后,可以产生296个大肠杆菌,约是8×1028个,8万亿亿亿个,远远超过人类有史以来的数量总和。有性生殖则通常需要两个个体各贡献一半DNA,然后再融合成一个个体,进而产生后代。例如:人类是父母双方分别产生精子和卵子,各包含23条染色体,然后精子和卵子融合成为受精卵再发育为个体。早期生命形式简单,无法采用复杂的有性生殖。当复杂的多细胞生命体出现后,有性生殖才成为普遍方式。所有的高等动物都是有性生殖。
高等动物普遍采用有性生殖,那克隆在高等生物中是否自然存在呢?答案是肯定的。例如同卵双胞胎,源自于同一个受精卵的分裂,具有同样的基因组。这也是人工克隆动物的一个思路,将早期胚胎分为多个小的胚胎,然后再分别发育成多个个体。这种方式的成功是建立在早期胚胎细胞的可塑性(plasticity)上,此时细胞的命运依然可逆并具有全能性,而后期细胞,特别是已经成熟的细胞并不具有这种特性。采用这种方式不仅在技术上存在困难,更为重要的是,因为必须用早期胚胎,这极大地限制了克隆的使用范围。很多特性必须要等到个体成熟后才能获知,而如果此时再想克隆此个体,或者像科幻电影中克隆已灭绝的生物,必须要换种思路:采用体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)技术。顾名思义,移植细胞核是这种方式的必要过程,也是和上一种方式的最大区别。高等动物的基因主要集中在细胞核内,将其细胞核移植到去核的卵子或早期胚胎中,再进一步发育,即可获得和被移植个体同特征的个体(图1)。体细胞核移植与胚胎分裂两种方式最大的区别就是前者使用体细胞核,通过不断扩增,数量上可以做到取之不尽,而且适用范围广。例如:上文提到的已灭绝生物无法找到胚胎细胞,只能使用体细胞核移植技术。狭义上的动物克隆就是指使用体细胞核移植技术的克隆,目前大多数动物克隆都是采用这种方式。
最早的动物克隆可以追溯到19世纪,是德国科学家汉斯·德里施(Hans Driesch)在研究动物发育时完成的。1885年,德里施轻轻摇动海胆(sea urchin)的胚胎,发现这有可能导致胚胎分裂,而且分裂后的胚胎依然可以长成正常的海胆。通常情况下,从胚胎发育成个体这个过程是不可逆的,细胞在这个过程中逐渐成熟,其全能性和可塑性都在逐渐降低。然而,这个实验证明了早期胚胎具有全能性和可逆性,为克隆的研究奠定了基础。
图1 细胞核移植克隆[3]
海胆的胚胎可以通过轻轻摇动分开,但其他动物的胚胎细胞之间的连接远比此紧密,需要一定方式将它们分开。1902年,德国科学家汉斯·斯皮曼(Hans Spemann)用婴儿头发做成套索固定在两个蝾螈(salamander)胚胎细胞之间,最终将它们分开,发现这两个细胞也可以长成两只蝾螈。如果是分裂进一步发育的胚胎细胞,则无法发育成蝾螈。这个实验说明早期胚胎细胞能够发育成个体,而更加后期的胚胎则不行。
20多年后的1928年,斯皮曼还在用婴儿头发和蝾螈胚胎做发育实验,但手法更加娴熟,也更加多样。这次他将蝾螈的受精卵用头发套索固定住,但只是挤压成两部分,并不分割它们。他发现含有细胞核的那部分可以继续发育,经过4次分裂后长成16个细胞。按照之前的经验,这16个细胞分开后是无法再发育成蝾螈的。但斯皮曼将头发套索拿掉后,这次产生了一个特殊的细胞,它包含受精卵的细胞质,而细胞核则是后期胚胎的细胞核。他将这个细胞单独分开后,发现它能够长成蝾螈(图2)。这次实验说明早期的细胞质对克隆来说非常关键,而细胞核则可以来源于较为成熟的细胞,为后来的细胞核移植提供了借鉴。
图2 1928年斯皮曼的蝾螈实验[4]
在以上实验的基础上,1952年,美国科学家罗伯特·布里格斯(Robert Briggs)和托马斯·金(Thomas King)成功地站在了巨人的肩膀上:将青蛙受精卵的细胞核移植到卵细胞中,并发育出胚胎。这是人类第一次用细胞核移植技术成功发育出胚胎,是克隆界的第一次里程碑式的进展。这次实验成功进行了104次核移植,培育出35个胚胎,其中27个成长为蝌蚪。这种发育成功率在普通人看来可能很低,但在克隆界算是很高了,比接下来提及到的克隆界后辈简直是高多了!这与此次实验采用的动物及细胞有关。首先,青蛙体外排卵,卵细胞体积大,非常便于实验操作;其次,细胞核来源于受精卵,本身具有发育成胚胎并长成个体的能力;最后便是青蛙受精卵在水中能成长发育,要求比较低。虽然实验看起来采取了特殊的模式,但依然意义非凡,因为即便今日人类依然不清楚细胞核的取出和移植对细胞有怎样的影响,这些影响非常有可能导致采用细胞核移植技术无法克隆成功,而这次实验的成功从结果上肯定了这个技术的可行性,为动物克隆开创了一片天地。
虽然青蛙克隆实验成功了,但人们的好奇心并不会因此而减弱,相反会变得更强,其中最重要的两个疑问是成熟的体细胞核能否移植并发育,其他动物能否被克隆。不久之后的1958年,第一个问题便有了答案。英国科学家约翰·戈登(John Gurdon)成功地将蝌蚪的肠上皮细胞的细胞核移植到青蛙卵细胞里,并发育出胚胎。
肯定了第一个问题后,第二个问题的答案也没有让人们等太久。1963年我国科学家童第周在世界上第一次成功克隆了亚洲鲤鱼,这次克隆是将一条雄性鲤鱼的细胞核移植到雌性鲤鱼的卵母细胞中。此外,1973年童第周还将亚洲鲤鱼的基因移植到欧洲鲫鱼中,第一次实现了种间克隆。童第周开创了中国克隆技术的先河,是实至名归的“中国克隆之父”。
哺乳动物的受精卵比青蛙或蝾螈的小得多,难以操作。直到1975年,英国科学家德里克·布鲁赫(Derek Bromhall)用微小的玻璃吸管将兔的胚胎细胞核移植到一个去核的兔卵子细胞中,并发育出了一个胚胎。这次实验表明了哺乳动物能够使用细胞核移植技术,但遗憾的是布鲁赫并未将胚胎转移到兔的子宫里面,所以胚胎未能发育成兔子。
1984年,丹麦科学家斯提恩·威拉德森(Steen Willadsen)在英国剑桥用化学方式将一个羊的胚胎分裂成8个细胞,然后通过电击方式,将这些细胞与去核的卵子相融合形成一个细胞。在这个时候,体外发育已经发展成熟,并应用于治疗人类不孕。所以威拉德森将这些羊的细胞转移到羊子宫中,并最终发育出3个羊羔。尽管是使用胚胎细胞,但这是第一次将核移植技术应用于哺乳动物,并发育出个体,是一次非常成功和有意义的实验。
高等动物牛的克隆发生在1987年,与1984年的实验方法类似,由于它们都使用胚胎分裂技术,而非用成熟的体细胞,影响力较小,没有受到很大关注。
很快,克隆便得到了前所未有的关注,让这个专业词汇从生物学走进了大众,走进了科幻电影。这就是1996年英国科学家基思·坎贝尔(Keith Campbell)和伊恩·威尔穆特(Ian Wilmut)用成熟体细胞成功克隆了一只羊——多莉。这是人类第一次用成熟的体细胞核成功克隆出哺乳动物,是克隆界的第二次里程碑式的突破。多莉一出生便名扬世界,应该是迄今为止世界上最为出名的动物,足以比拟当红明星,即便死后知名度依然不减。277次核移植,产生29个胚胎,放入13个代孕母羊子宫,最后有且只有多莉幸运地出生了[5]。这次艰辛而又享誉世界的实验——从这组数据上可以看出——比起克隆界的前辈在概率上小太多了,只出生了一只,这还是建立在科研人员数百次的辛勤工作上,可能还有幸运的成分。多莉有3个母亲子宫,分别为它提供了细胞质、细胞核和子宫,它活了6年多,于2003年去世,3次生育共有6个后代。科研成果能够在第一时间就引起大众关注的并不多,引起大众关注并且有真正重大突破的可能还要再少一个数量级,而多莉绝对算是其中最亮眼的之一。它不仅第一时间进入了各大新闻版面,还给克隆界注入了迄今为止最为强劲的强心剂。多莉的诞生证明了克隆高等动物的可行性,并且可以正常生活和生育。自此之后,多种高等动物如雨后春笋般被克隆成功。
目前已经被克隆的高等物种有20多种,其中克隆牛和鼠诞生在1997年,和人类相近的猕猴在1999年用胚胎分离克隆成功,克隆猪是2000年,兔、骡子、鹿和马在2003年克隆成功,克隆狗、果蝇在2005年诞生,2009年克隆骆驼在迪拜诞生。近几年来随着科学的发展,克隆的应用更加广泛并开始走向商业。2009年一种灭绝的庇里牛斯山羊(Pyrenean ibex)被克隆成功,这是第一种已经灭绝的物种被克隆,虽然它仅活了7 min,但为灭绝动物的再生打开了一扇窗口。2014年,深圳华大基因报道每年生产500只克隆猪,成功率为70 %~80 %。结合热门的基因编辑技术,2017年一只基因编辑的狗在另一家中国公司诞生。
克隆技术在最近20年发展迅速,但与人类相近的非人灵长类动物的克隆进展并不顺利。虽然可以进行核移植、电击融合和胚胎发育,然而直到2017年克隆猴才成功出生在中国,而且先后出生了2只,分别是“中中”和“华华”,这也让中国的克隆走到了世界的最前列。这是克隆领域在自从多莉诞生后的最大突破,并且真正地具有了一定的应用前景,是克隆界的第三次里程碑式进展。
自从克隆羊多莉诞生之后,最近二十多年来克隆技术的发展越来越快,多种动物相继被克隆成功,此时,大众关心的一个核心问题就是克隆人距离我们到底还有多远。
在2004年,韩国科学家黄禹锡宣称已经克隆了人类胚胎,立即引起很大争议。后来证明这是一次科学上的造假,实际并没有克隆出人胚胎。2013年,俄裔美国科学家米塔李波夫(Shoukhrat Mitalipov)使用皮肤细胞克隆了人类胚胎细胞,同样在安全和伦理上引起了很大争议。目前世界各国普遍禁止任何有关克隆人的研究。
克隆技术说起来并不复杂,将细胞核转入到卵母或胚胎细胞质中,然后即可像受精卵一样发育。然而探索一个多世纪后,这其中的基本问题依然很多,例如:去核过程对细胞有什么影响?被移植的细胞核在进入胚胎细胞质之后发生了什么?克隆的成功率和这些有没有关系?有什么关系?如何让受精卵在体外更好地发育?这些问题还需要时间和广大科研人员的努力,而且目前看起来并不会轻松。当然,这些问题可能都不是克隆人能否成功的关键因素,毕竟多种动物,特别是克隆猴,都已经克隆成功,在生物学上人类和它们并没有本质区别,可能只是技术上更难一些而已。我们距离克隆人可能只有一个玻璃窗的距离,而且这个玻璃窗主要是由于伦理问题导致世界各国普遍禁止克隆人研究。从技术上讲我们距离克隆人非常地近,但伦理道德和法律禁止人们踏出这一步[6]。
克隆技术的发展已逾百年,目前可以说取得了极大的突破。与其他很多基础科研一样,大家通常都要问问,克隆对我们到底有什么用?我只能给出一个比较令人失望的答案,克隆至今对人类来说依然没什么实际用处。
虽然我们能够克隆多种动物,但由于造价昂贵,至今还未找到实用价值。目前唯一有应用前景的就是克隆猴,由于它与人类非常相似,克隆猴在神经科研和医疗研究方面具有较大的前景,但能否实现还需要看后续的发展,例如时间和经济成本。
那么就会有人问了,克隆技术并没有带来实际的应用价值,为什么在过去一百多年我们还会一直研究它?这个问题其实不是针对动物克隆,而是针对所有基础科研。基础科研的特点之一就是在短期内它确实没什么用处,甚至也无法预见它将来的用处,正如无法预测一个婴儿将来会做什么一样。基础科研本质上是人类对世界的好奇心,我们想知道和了解这个世界如何运转,进而能够加以改造,让这个世界能够更好地运转,或者说按照人类更想要的方式运转。然而,了解到改造通常都有比较远的距离,往往需要历经百年以上的时间,超过了人的一生。我们应当以正确的态度看待基础科研,急功近利不可取。
克隆技术从一百多年前到现在,可以说一直没什么实际应用,但它的意义在这个过程中一直存在,那就是让我们更好地认识了这个世界,认识了生物,认识了人类自己。与此同时,我们也正期待着它会给我们带来一个更好的世界。
(2018年5月7日收稿)■