脂联素和脂联素受体1在不同病程糖尿病大鼠心肌缺血预适应中的变化*

郭竹英， 徐芒华， 赫 玮， 王世婷△

(上海交通大学医学院附属第九人民医院1检验科，2实验中心，上海 201900)

随着临床冠脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术和动脉搭桥等手术的发展，缺血再灌注(ischemia-reperfusion, IR)损伤在临床中十分常见且难以避免，是影响缺血性疾病治疗效果的重要因素。糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者心肌梗死的发病率明显高于非糖尿病患者，如何预防与治疗糖尿病患者的IR损伤越来越受到人们的关注。1986年Murry等[1]提出心肌缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)的概念，即预先1次或反复短时间缺血可以对随后长时间缺血再灌注损伤的心肌产生保护作用，是一种有效的内源性保护机制。此后，大量实验证实IPC在心肌缺血再灌注损伤中具有减少心肌梗死面积、降低心律失常发生率和保护心肌舒缩功能的作用，这种被大量实验证实有效的缺血再灌注心肌保护方法在糖尿病动物模型上却出现了不同的结果[2]:早期轻度糖尿病的心肌通过上调PI3K/Akt信号通路，使细胞凋亡相关基因表达下调而表现出对IR敏感性降低,损伤减轻[3];但随着诱导时间的延长，心肌细胞对IR损伤敏感性增高[4]，IPC的心肌保护效果明显减弱。而我们在1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)模型大鼠离体心脏实验中发现T1DM大鼠4周时对IR损伤的耐受性增强，IPC保护作用弱于对应的正常大鼠,8周时IPC保护作用消失[5]。糖尿病的持续时间可能是影响心肌对IR损伤敏感性和IPC保护作用的重要因素。

脂联素(adiponectin，APN)基因是Scherer等[6]于1995年对小鼠3T3-L脂肪细胞cDNA测序时发现的一段新序列，有研究表明敲除APN基因的大鼠心肌细胞IR损伤加重，心肌梗死面积明显扩大[7-8];在正常和糖尿病鼠转染APN后，IR损伤所致的心肌梗死面积及心肌细胞凋亡指数均降低[9-10]，因此APN在正常和DM鼠IR损伤心肌中均具有保护作用，但在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)中APN的这种心肌保护作用降低[11]。脂联素的这些效应必须通过脂联素受体的介导来完成。2003年Yamauchi等[12]从Ba/F3细胞中提取出APN特异性受体的cDNA，把其编码的2种蛋白质分别命名为脂联素受体1(adiponectin receptor 1，Ad-R1)和脂联素受体2(adiponectin receptor 2，Ad-R2), Ad-R1主要分布在骨骼肌和心肌，Ad-R2主要分布在肝组织，脂联素通过结合脂联素受体发挥其作用。虽然Ad-R1和Ad-R2已被克隆，研究表明这些受体的刺激与葡萄糖稳态有关[13]，但关于Ad-R在糖尿病IR和IPC中的表达变化及其与APN在两类糖尿病大鼠的心肌IR损伤和IPC保护中的作用差异研究较少。

因此本研究制备T1DM和T2DM模型大鼠，观察不同病程对DM大鼠IPC的影响， 并探讨心肌APN与Ad-R1在1型及2型糖尿病大鼠心肌IR损伤和IPC保护作用中的变化，为更好地判断糖尿病心血管疾病预后及治疗提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1动物及饲料 选取8～10周龄清洁级Sprague-Dawley (SD)大鼠250只，体质量(192±23) g，雌雄兼用，生产许可证：西普尔-必凯实验动物有限公司 SCXK(沪)2003-0002，自由饮食，在室温20～23 ℃、湿度45%条件下饲养，实验前在恒温室[(20±3) ℃]饲养适应1周，选出生长正常的健康动物。高脂饲料购自上海斯莱克实验动物有限公司，含猪油15%、蛋黄粉10%、胆固醇2%、胆酸0.02%和基础饲料72.98%，脂肪供能比为48%。

1.2主要试剂 链脲佐菌素(streptozocin，STZ)购自Sigma (Cat: S0130)；兔抗大鼠脂联素受体1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(Cat: bs-0610R)；HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L) II抗购自Jackson ImmuoResearch (Cat: 111-035-003)；Wes-tern blot化学发光试剂盒购自Millipore (Cat： WBKLS0100)；大鼠胰岛素检测试剂盒购自Mercodia (Cat: 16070)；脂联素检测试剂盒购自Assaypro (Cat： ERA2500-1)。

2 方法

2.1DM动物模型制备和采血 T1DM组：85只SD大鼠普通饲料喂养 1 个月，禁食12 h后腹腔注射高剂量STZ(0.1 mol/L，枸橼酸缓冲液溶解)，60 mg/kg，继续普通饲料喂养，72 h后空腹剪尾采血，采用OneTouch血糖测定仪(LifeScan)测定血糖，血糖大于16.7 mmol/L，持续1周以上，并出现糖尿病“三多一少”症状(多饮、多食、多尿、体重减轻)定为造模成功，继续普通饲料喂养；T2DM组：85只SD大鼠用高脂饮食喂养1个月后，禁食12 h，腹腔注射低剂量STZ(0.1 mol/L，枸橼酸缓冲液溶解)35 mg/kg，72 h后空腹剪尾采血测定血糖，血糖大于16.7 mmol/L，持续1周以上，胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)高为造模成功，继续高脂饮食喂养；正常对照(normal)组：取SD大鼠80只，用普通饲料喂养，腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。每2周空腹后剪尾采血测定血糖并测体重1 次，3组大鼠分别在注射STZ和枸橼酸缓冲液后4周和8周眼眶静脉丛采集血样分离血清，-80 ℃保存备用，离心后测定胰岛素和脂联素。所有大鼠专人饲养，自由饮食、饮水，不给予胰岛素等降糖治疗。

2.2DM动物模型分组 大鼠注射STZ和枸橼酸缓冲液4周及8周后，将成功建模的大鼠再分为4周和8周组,共6组，每组剔去一般情况特别不好的大鼠，进一步筛选出40只备用以防Langendorff方法建立离体心脏体外灌流模型时偶尔的不成功；在进行Langendorff灌流时normal、T1DM和T2DM这3组大鼠再分别随机分为对照(control, Con)组、IR组和IPC组，确保每个亚组有12只大鼠，其中6只大鼠心脏用于心肌梗死面积测定，6只用于制备组织匀浆。

2.3Langendorff方法建立离体心脏体外灌流模型 取出心脏立即放入0～4 ℃ Krebs-Henseleit (K-H)液中，轻轻挤压心脏，排空心脏内残留的血液，将主动脉固定于灌流装置中的心脏套管上，立即用95%O2+5%CO2饱和的K-H液进行逆行灌流。K-H液的成分为(mmol/L)： NaCl 118.4， KC1 4.7， MgSO41.1， KH2PO41.18， NaHCO324.5， CaCl22.55， glucose 1.1， pH 7.4。富氧灌流液充以95%O2+5%CO2混合气体，乏氧灌流液充以95%N2+5%CO2混合气体。IR组心脏富氧灌流液灌流15 min(预灌)，乏氧灌流液灌流30 min(缺血)，富氧灌流液再灌流40 min(再灌注)；IPC组心脏预灌后，乏氧灌流液灌流5 min(短暂缺血)，富氧灌流液灌流5 min(短暂复灌)，重复3次，再行长时间缺血再灌注处理(同IR组)； Con组大鼠心脏富氧灌流液灌流100 min。

2.4血清胰岛素水平测定 胰岛素检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，按试剂盒操作说明检测，并计算HOMA-IR，其计算公式为：HOMA-IR=空腹血糖水平(mmol/L)×空腹胰岛素水平(mU/L)/22.5。

2.5血清脂联素水平测定 采用ELISA方法按照试剂盒(Cat： ERA2500-1； Lot： 031101003)说明检测大鼠血清脂联素水平,按1∶500稀释血清标本，用Model 680型酶标仪(Bio-Rad)读取450 nm处的吸光度。

2.6灌流冠脉流出液肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定 根据前期预实验结果，收集各组大鼠最后一次再灌流(40 min再灌注)期间10 min这一时点的冠脉流出液，采用速率法在LX20型全自动生化分析仪(Beckman Coulter)上测定冠脉流出液中CK和LDH的活性。

2.7左心室乳头肌超微结构改变 每组随机选取1只大鼠，再灌注结束后，将表面水分吸除后将心室腔暴露，用夹子夹住并取左室乳头肌，之后用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，进一步脱水、包埋、切成超薄切片，然后随机选取一部分用醋酸双氧铀-枸橼酸铅染色。H-7500型透射电镜(Hitachi)观察超薄切片，拍照并观察乳头肌超微结构。

2.8心肌梗死区域面积的测定 采用四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)染色法测量心肌梗死面积。每组随机选6只大鼠，灌注结束后剪去心房，吸干心脏表面水分，置于-20 ℃冰箱1 h后取出，趁未解冻前将心脏从心尖向心底方向切片，每片厚约3 mm，浸于pH 7.4、0.25%的NBT磷酸盐缓冲液中，放入37 ℃恒温水浴箱孵育10 min，其间每分钟搅拌1次，非梗死区染为蓝色，梗死区不染色。随后置于10%甲醛溶液固定约20 min。将处理后的切片固定于2层树脂玻璃中间并拍照，之后采用Image Tool软件计算心肌梗死区域所占比例。

2.9心肌组织匀浆的制备 每组随机选6只大鼠，再灌注结束后剪去心房，吸干心脏表面水分后，称取100～200 mg组织,剪成小块,置于2.0 mL EP管中，用预冷PBS洗涤1～2次，按照1 ∶9的比例加入PBS制备匀浆，-80 ℃保存用于检测APN和Ad-R1表达水平。

2.10心肌组织APN水平检测 取上述组织匀浆，4 ℃、500×g离心3 min，上清用于ELISA检测，按照大鼠ELISA试剂盒说明书检测上清液中脂联素水平。上清液用样本稀释液1∶50稀释，Model 680型酶标仪读取450 nm处的吸光度(A)值。

2.11心肌组织Ad-R1水平检测 取大鼠心肌组织的匀浆样本进行Western blot。目的蛋白的I 抗稀释度为1 ∶400，抗GAPDH的 I 抗稀释度为1∶6 000，4 ℃过夜，II 抗[山羊抗兔IgG(H+L)，稀释度为1 ∶2 000] 室温振荡孵育2 h，洗涤后显影。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对各条带的总灰度值作相对定量比较分析。

3 统计学处理

定量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，采用统计软件SPSS 17.0进行正态性检验、方差齐性检验和单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组间两两比较用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05差异有统计学意义。

结 果

1 T1DM和T2DM大鼠模型制备和血清脂联素水平

如表1所示，T1DM大鼠血糖≥16.7 mmol/L，体重较正常大鼠减轻，表明造模成功；T2DM大鼠血糖≥16.7 mmol/L，HOAM IR明显高于正常和T1DM大鼠，说明造模成功；糖尿病大鼠血清APN水平明显低于正常组，尤以T2DM为低。

表1 DM模型制备后各组大鼠体重、血糖、血清胰岛素和血清APN水平以及HOMA-IR的变化

*P<0.05vsnormal group.

2 离体心脏灌流冠脉流出液中LDH与CK活性情况

如图1所示，与Con组相比，IR组大鼠(包括normal、T1DM和T2DM)心脏冠脉流出液中的LDH和CK活性显著增加(P<0.01)；糖尿病大鼠(包括T1DM和T2DM)4周时，IPC组较IR组的LDH和CK活性显著降低(P<0.01)，而8周时两组LDH和CK活性的差异无统计学显著性。

Figure 1. The changes of LDH (A) and CK (B) released in coronary effluent after reperfusion in all groups. Mean±SD.n=12.**P<0.01 Con group;##P<0.01vsIR group.

3 左室乳头肌超微结构改变

电镜下可见normal大鼠Con组左室乳头肌线粒体、核膜完整，嵴清晰，肌小节完整，肌丝排列整齐；糖尿病大鼠8周 时Con组部分线粒体轻度肿胀，可见收缩带或空泡，而IR组表现为线粒体肿胀，呈空泡状，嵴消失或变形，肌丝溶解甚至消失，肌小节结构破坏，细胞核内染色体核边聚等改变；normal大鼠IPC组较糖尿病IPC组线粒体上述改变均有不同程度的改善，见图2。

4 实验大鼠心肌梗死区域面积的改变

在normal、T1DM和T2DM大鼠IR组的心肌梗死区域面积较对应的Con组均显著增加(P<0.01)；T1DM和T2DM大鼠4周时的IPC组较IR组心肌梗死区域面积显著降低(P<0.01)，而8周时，IPC组较IR组心肌梗死区域面积略有降低，但差异无统计学显著性,见图3。

Figure 2. Transmission electron microscopic images of left ventricular papillary muscles from the rats in all groups at 8 weeks. Scale bar=2 μm.

5 实验大鼠心肌组织APN含量的改变

Normal和T1DM大鼠Con、IR和IPC各组的心肌组织脂联素含量均无改变；但T2DM大鼠IR组的心肌组织脂联素含量在4和8周时均较Con组明显减少(P<0.01)，T2DM大鼠IPC组4周时的脂联素含量明显高于IR组(P<0.05)，而8周时2组结果的差异无统计学显著性,见图4。

6 大鼠心肌组织Ad-R1表达水平

Western blot结果显示，normal大鼠Con、IR和IPC各组的心肌组织Ad-R1表达量均无改变；而T1DM大鼠中， IR组4周和8周的心肌组织Ad-R1表达量较Con组明显增加(P<0.01)，IPC组较对应IR组Ad-R1表达量降低(P<0.01)；同样，在T2DM大鼠，IR组4周和8周的心肌组织Ad-R1表达量较Con组明显增加(P<0.01)，而IPC组4周较对应IR组Ad-R1表达量降低(P<0.01)，8周时2组Ad-R1表达量的差异无统计学显著性，见图5。

讨 论

心肌缺血预适应是心肌经过几次反复短暂的缺血后，对随后长时间持续性缺血损伤耐受性增强的一种适应性机制，是防止心肌IR损伤的有效方法[14]，目前研究[15]认为IPC是心脏的一种自我保护机制，可触发心脏在缺血早期释放某些内源性活性物质，经中介物激活效应物，通过细胞内多介质多途径的信号转导系统调节心脏功能。本研究结果显示无论是T1DM还是T2DM模型大鼠，4周时IR组的LDH及CK活性和心梗面积均较各自的Con组显著增加，4周时IPC组中各损伤指标较IR组明显回落，而8周时IPC组各指标较对应的IR组无明显差异，表明T1DM和T2DM模型大鼠在4周时有IPC保护作用，但到8周时这种保护作用基本消失；normal组大鼠4周和8周时IPC组的LDH与CK活性、心肌超微结构改变及心肌梗死面积较对应的IR组均有明显改变，normal组大鼠始终存在IPC保护。进一步分析实验数据发现，DM大鼠4周时IR组的LDH和CK活性及心肌梗死面积都小于normal大鼠4周的IR组我们曾报道的超微结构也显示T1DM大鼠4周时IR组的心肌线粒体明显肿胀，部分肌丝溶解、肌小节结构破坏，但损伤程度较大鼠4周时IR组轻[5]，与本次T2DM大鼠4周时的结果相似。以上结果提示1型和2型糖尿病早期如4周时其本身所致的较轻的心肌损伤都可能是一种预适应，可减轻IR损伤。糖尿病早期对抗IR损伤的耐受力增强，随着糖尿病病程的延长，其心肌对IR损伤的抵抗作用减弱。根据这一现象，Hadour等[16]推测机体在糖尿病早期可能产生了“代谢预适应”，这种适应在糖尿病早期发挥了抗氧化、抗凋亡、保护心肌的作用。随着糖尿病时间的延长，其本身所致的心肌损伤也加重，IPC保护作用消失(DM大鼠8周时IPC组电镜所示的心肌超微结构损伤与相应IR组近似)。长期高脂环境引起能量代谢障碍，心肌耗氧量增高和心肌细胞衰老导致对缺血缺氧的耐受力下降，而在缺血再灌注过程中，大量氧自由基和炎症因子的释放,使体内氧化-抗氧化系统失衡，使心肌处于氧化应激状态而加重了糖尿病患者心肌的IR损伤。有研究表明老年鼠由于心脏氧化应激水平增加，致线粒体损伤和细胞凋亡，从而导致心脏IPC保护作用减弱[17]。DM大鼠随着时间延长，eNOS表达上调，氧化应激增加，细胞凋亡[4]。这种氧化应激通路的变化是DM大鼠8周时IPC保护作用减弱或消失的原因之一。

Figure 3. The changes of myocardial infarct area in all groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsIR group.

Figure 4. The changes of APN levels in the cardiac tissue in all groups. Mean±SD.n=6.** P<0.01vsCon group;##P<0.05vsIR group.

脂联素是脂肪组织分泌的一种脂肪细胞因子，在血清中含量丰富，与肥胖、脂代谢异常及T2DM的抗心肌IR损伤等密切相关，研究发现心肌细胞等均可分泌APN[18]。当在体心脏发生IR损伤时血清APN通过结合受体发挥抗心肌IR损伤等作用，当离体心脏IR损伤时心肌局部分泌具有生物活性的APN，保护心肌免受IR损伤，其机制与Ad-R1变化和降低氧化硝化应激有关[8]。我们检测了心脏离体实验前血清APN含量和离体实验后心肌组织APN含量和Ad-R1蛋白表达水平，结果显示，normal组大鼠心肌APN和Ad-R1经IR和IPC处理后较Con处理无变化，说明心肌APN和Ad-R1不参与正常大鼠离体心脏的IR损伤和IPC保护作用。T1DM组大鼠血清APN较正常大鼠降低，离体心脏行IR处理后较Con组心肌APN无变化，但心肌Ad-R1表达较Con组升高。这种升高可能与血清APN下降有关。APN由脂肪组织分泌，T1DM大鼠体重下降、脂肪组织减少而导致血清APN减少；当行离体心脏IR处理时，心肌分泌APN又没有变化，可能导致心肌本身通过升高Ad-R1表达来对抗IR损伤；当行IPC处理时心肌损伤较IR组轻，心肌Ad-R1表达较IR组减少，IPC组的Ad-R1表达量较IR组显著降低，同时结合T1DM离体心脏经IR和IPC处理其心肌APN含量均无变化，推测T1DM离体心脏早期IPC保护作用与心肌分泌APN无关，但可能与心肌Ad-R1有一定关联。有研究报道在T1DM心肌细胞Ad-R1表达随着糖尿病持续时间而变化，低脂联素血症是T1DM小鼠IR损伤的主要原因[10, 19]。T2DM组大鼠血清APN较正常和T1DM大鼠更为降低，离体心脏行IR处理后较Con组心肌APN明显减少，心肌Ad-R1表达升高，4周时大鼠心肌APN含量IPC组较IR组明显回升，Ad-R1较IR组显著下降，8周大鼠IPC组较IR组心肌APN含量和Ad-R1表达均无变化。这些结果提示4周时T2DM大鼠IR损伤与心肌APN含量下降有关，心肌分泌的APN参与了T2DM大鼠早期的IPC保护作用。T2DM大鼠心肌APN与Ad-R1表达量变化关系提示，4周时T2DM大鼠经IR处理，Ad-R1代偿性升高以弥补APN含量的下降所致的心肌损伤，推测T2DM大鼠IR处理本身产生了心肌局部的低脂联素症；而IPC组较IR组心肌Ad-R1表达水平下降考虑与心肌APN含量较高足以维持心肌保护作用有关，推测IPC处理可改善IR处理所致的局部低脂联素症。随着病程延长，8周时T2DM大鼠血清和心肌APN含量进一步降低，Ad-R1的调节功能衰退，最终导致IPC保护作用消失。有研究表明心肌APN和Ad-R1蛋白表达下降以及胰岛素抵抗促进2型糖尿病心肌病的发生发展[20]，这可能是后期T2DM大鼠心肌IPC保护作用减弱甚至消失的因素之一。

Figure 5. The changes of Ad-R1 levels in cardiac tissue in all groups. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsIR group.

综上所述，在1型和2型糖尿病大鼠，糖尿病本身可致心肌损伤，早期产生“预适应”保护作用，对IR损伤的耐受性较正常大鼠增强，且随着时间的延长这种损伤逐渐加重，在4周糖尿病心脏IPC具有一定的保护作用但弱于正常大鼠，到了8周，糖尿病心脏对缺血耐受性差，IPC保护作用基本消失。T1DM离体心脏早期IPC保护作用与心肌分泌APN无关，但可能与心肌Ad-R1有一定关联。T2DM大鼠IR处理本身导致心肌局部的低脂联素症，早期IPC处理可改善这种局部低脂联素症。心肌组织APN和Ad-R1在T2DM早期抗心肌IR损伤中发挥重要作用，参与了T2DM大鼠的IPC保护作用，提示APN可能就是T2DM心肌在缺血早期释放的内源性活性物质之一。