黄芪多糖对COPD大鼠炎症反应和肺功能的影响

靳 娜 孟德维 杜 晓

（1.河北省廊坊市第四人民医院，河北 廊坊 065700；2.包头医学院第二附属医院，内蒙古 包头，014000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是中老年呼吸系统疾病的常见病和多发病，流行病学调查研究显示我国COPD发病率达8.2%［1］，主要表现为气道炎症和肺功能降低。多味中药均具有改善炎症反应和肺功能的作用，如活血化瘀的三七、葛根，甚至具有养阴功效的生地黄、玄参也具有上述作用。而从中医本草理论认为，黄芪益气扶正，对慢性炎症（正虚邪结）、肺功能低下（肺气亏虚）均具有改善作用。现代药学研究发现，黄芪多糖（APS）是中药黄芪的主要活性成分之一，有研究发现黄芪多糖具有抑制哮喘大鼠呼吸系统炎症并改善肺功能的药理学作用［2-3］，但黄芪多糖对COPD大鼠炎症反应及肺功能的影响的文献报道尚不多见，本研究将对这一问题进行实验研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量220～250 g，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。 饲养环境：温度 23～25 ℃、相对湿度65%～70%、光照周期12 h∶12 h，正常进食、饮水。适应性饲养1周后进行实验。

1.2 试药与仪器 1）试药：黄芪多糖购自西安沃森生物科技有限公司（批号：20170120）；醋酸泼尼松片购自天津力生制药股份有限公司（批号：20170316）；白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司（批号分别为：170106、161129、170305、170226）。 2）仪器：倒置光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；iMark型酶标仪（美国 Bio-Rad公司）；HM325型石蜡切片机（德国Microm公司）；LEAD-7000型多导生理记录仪（北京豪迈世纪医疗器械有限公司）；BG-800型血气分析仪（梅州康立高科技有限公司）。

1.3 造模与分组 取120只实验用大鼠按照随机数字表法随机分为6组，即正常对照组，模型组，黄芪多糖100、200、400 mg/kg组和泼尼松6 mg/kg组（阳性药对照组），每组20只。参照李红梅等［4］报道的实验方法复制COPD大鼠模型：造模时间共需28 d，第1日、14日实施麻醉后经气管注入200 μL脂多糖 （1 g/L），第2～28日（第14日除外）置于密封的1 m3烟室中，持续吸入香烟烟雾30 min（含焦油量19 mg、尼古丁1.2 mg），每日1次；正常对照组不做任何干预。通过胸部X光片进行评估，出现明显增厚肺组织和阴影形态不规则表明COPD模型建立成功［5］，结果见图1。

图1 大鼠胸部X光片

1.4 干预方法 造模过程中，黄芪多糖各剂量组（生理盐水溶解）和泼尼松组（研碎后，生理盐水溶解）每天注入脂多糖或烟熏前30 min灌胃给予黄芪多糖或强的松，正常对照组同步灌胃给予0.9%氯化钠注射液。

1.5 标本采集与检测 1）大鼠一般生存状态及肺组织状态的观察：第29日时，观察各组大鼠一般生存状态，包括大鼠皮毛、饮食、呼吸、体质量等。麻醉后取肺组织，肉眼观察肺组织整体形态。2）肺脏组织病理学改变的观察：取肺脏组织，置于多聚甲醛溶液（浓度4%）固定3 d，然后依次行石蜡包埋、切片、脱蜡水化处理后，行常规HE染色后通过倒置光学显微镜观察肺脏组织形态和细胞结构。3）血清和肺组织炎症细胞因子检测：麻醉后开腹，经腹主动脉取血，1500 r/min离心5 min取血清；取血完成后取肺脏组织，于4℃恒温环境剪碎后，加入适量冷0.9%氯化钠注射液制备浓度为10%的肺组织匀浆液，3000 r/min离心10 min取上清液；参照各指标ELISA检测试剂盒操作说明，通过酶标仪检测血清中和肺组织中炎症细胞因子IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量。 4）肺功能指标检测及血气分析：第29日时实施麻醉，行气管插管后连接多导生理记录仪测定肺功能指标（VE、PEP和FEV1）；颈动脉采血后行血气分析（PaO2、PaCO2、pH）。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计处理。计量资料以（±s）表示，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般生存状况 正常对照组大鼠精神状态良好、反应灵活，皮毛有光泽，饮食正常，体质量增长正常，呼吸正常，无呼吸困难、喘息等；模型组大鼠精神不振、反应迟钝，皮毛无光泽、发黄，食欲不振，体质量下降、形体消瘦，出现咳嗽、喘息、闻及哮鸣音及痰鸣音等呼吸系统病症；黄芪多糖各剂量组和泼尼松组大鼠精神状态、呼吸、饮食等一般生存状况均明显改善，以黄芪多糖400 mg/kg组最为显著。

2.2 各组大鼠肺组织整体肉眼观察 肉眼观察发现：正常对照组大鼠肺组织体积正常、呈淡红色、表面光滑、弹性好；模型组大鼠肺组织体积明显增大、呈暗紫红色、表面粗糙、边缘变钝，弹性降低；较模型组，黄芪多糖各剂量组和泼尼松组大鼠肺脏组织整体状况明显好转，以黄芪多糖400mg/kg组最为显著。

2.3 各组大鼠肺组织病理学改变观察结果 见图2。经HE染色后观察发现，正常对照组大鼠肺组织肺小叶结构正常，未见明显细胞变性、坏死和脱落，无充血、水肿，间质未见炎性细胞浸润；模型组大鼠肺小叶结构出现异常、出现明显的细胞变性、坏死和脱落，部分肺泡明显扩大，肺泡壁出现断裂，间质出现炎性细胞浸润；较模型组，黄芪多糖各剂量组和泼尼松组大鼠肺脏组织病变明显好转，以黄芪多糖400 mg/kg组最为显著。

图2 各组大鼠肺组织病理学改变（HE染色，400倍）

2.4 各组大鼠血清中炎症细胞因子含量比较 见表1。与正常对照组相比，模型组大鼠血清中IL-8、TNF-α含量显著升高而IL-10、IFN-γ含量显著降低 （P<0.01）；与模型组比较，黄芪多糖 200、400 mg/kg组和泼尼松6 mg/kg组大鼠血清中IL-8、TNF-α含量显著降低且IL-10、IFN-γ含量显著升高 （P<0.05或P<0.01）。

表1 各组大鼠血清中炎症细胞因子含量比较（ng/L，±s）

表1 各组大鼠血清中炎症细胞因子含量比较（ng/L，±s）

与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组 别 n正常对照组 10模型组 10黄芪多糖100 mg/kg组 10 IL-8 IL-10 TNF-α IFN-γ 231.70±17.94 21.35±2.31 47.28±3.85 7.85±1.94 441.58±30.76** 10.96±1.84** 115.06±5.84** 3.97±1.26**422.73±31.08 12.61±1.95 107.34±6.13 4.15±1.35黄芪多糖 200 mg/kg组 10 385.19±27.95△ 15.28±2.27△ 86.82±5.20△ 4.76±1.60△黄芪多糖 400 mg/kg组 10 346.15±23.47△△ 17.72±2.40△△ 68.95±4.52△△ 5.03±1.58△泼尼松 6 mg/kg组 10 372.93±25.19△ 14.98±2.06△ 79.16±4.81△ 5.84±1.62△△

2.5 各组大鼠肺组织炎症细胞因子含量比较 见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织IL-8、TNF-α含量显著升高而IL-10、IFN-γ含量显著降低 （P<0.01）；与模型组比较，黄芪多糖 200、400 mg/kg组和泼尼松6 mg/kg组大鼠肺组织IL-8、TNF-α含量显著降低且IL-10、IFN-γ含量显著升高 （P<0.05或P<0.01）。

表2 各组大鼠肺组织中炎症细胞因子含量比较（ng/L，±s）

表2 各组大鼠肺组织中炎症细胞因子含量比较（ng/L，±s）

组别 n正常对照组 10模型组 10黄芪多糖100 mg/kg组 10 IL-8 IL-10 TNF-α IFN-γ 376.49±8.25 26.18±3.46 150.32±10.25 13.72±2.03 469.17±13.62** 14.27±2.78**231.76±16.08** 5.93±1.31**451.36±14.15 15.80±2.96 220.81±15.90 6.28±1.46黄芪多糖 200 mg/kg组 10 435.19±12.03△ 18.19±3.17△ 197.62±13.35△ 7.36±1.75△黄芪多糖 400 mg/kg组 10 416.37±10.28△△ 21.69±3.12△△ 174.38±12.45△△ 9.27±2.16△△泼尼松 6 mg/kg组 10 427.86±11.17△△ 18.42±2.65△ 194.75±12.93△ 10.41±1.93△

2.6 各组大鼠肺功能指标比较 见表3。与正常对照组比较，模型组大鼠VE、PEP、FEV1及 FEV1/PEP均显著降低（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，黄芪多糖200、400 mg/kg组和泼尼松6 mg/kg组大鼠VE、PEP、FEV1及 FEV1/PEP比值均不同程度升高 （P<0.05 或P<0.01）。

表3 各组大鼠肺功能指标比较（±s）

表3 各组大鼠肺功能指标比较（±s）

组 别 n正常对照组 10模型组 10黄芪多糖100 mg/kg组 10 VE（L） PEP（L） FEV1（L） FEV1/PEP 195.83±25.18 33.06±1.94 8.42±0.25 0.25±0.08 117.34±27.51** 22.47±1.85** 4.13±0.49** 0.18±0.06*130.28±29.16 23.04±2.17 4.77±0.45 0.20±0.09黄芪多糖 200 mg/kg组 10 148.05±28.35△ 26.39±2.11△ 5.68±0.57△ 0.22±0.05△黄芪多糖 400 mg/kg组 10 156.37±32.49△ 28.45±2.08△△ 7.04±0.65△△ 0.24±0.09△泼尼松 6 mg/kg组 10 164.24±29.62△△ 30.19±2.20△△ 7.83±0.57△△ 0.26±0.08△

2.7 各组大鼠血气分析结果比较 见表4。与正常对照组比较，模型组大鼠PaO2、pH显著降低且PaCO2显著升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，黄芪多糖200、400 mg/kg 组和泼尼松 6 mg/kg 组大鼠 PaO2、pH显著升高且PaCO2显著降低（P<0.05或P<0.01）。

表4 各组大鼠血气分析结果比较（±s）

表4 各组大鼠血气分析结果比较（±s）

组 别 n正常对照组 10模型组 10黄芪多糖100 mg/kg组 10 PaO2（mmHg）PaCO2（mmHg） pH 83.02±2.97 51.27±2.35 7.35±0.2 51.24±3.05** 60.85±3.47** 7.19±0.06**58.41±3.75 58.12±3.60 7.21±0.06黄芪多糖 200 mg/kg组 10 66.05±3.98△ 54.78±3.13△ 7.29±0.05△黄芪多糖 400 mg/kg组 10 78.46±4.15△△ 53.61±3.19△ 7.31±0.07△泼尼松 6 mg/kg组 10 65.38±4.37△ 55.90±2.75△ 7.27±0.05△

3 讨 论

COPD是以气流受限、肺部炎症伴随肺功能降低为主要特征。COPD的发病率呈逐年上升的趋势，但由于早期症状轻微，患者就诊意识较差，导致COPD早期诊断率低于发病率［6］。COPD发病机制复杂，目前仍具有较高的病死率，也是临床上亟待解决的难题之一。气管内滴注脂多糖加烟熏制备的COPD大鼠模型与临床COPD患者病理机制近似［4］，是动物实验研究中常用的造模方法。

黄芪首载于《神农本草经》，是豆科植物黄芪的干燥根，味甘，性微温，具有益气补虚之功效。现代药学研究发现，黄芪多糖（APS）是其主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、增强机体免疫功能等多种生物学作用［2，7-8］。本研究通过气管内滴注脂多糖加烟熏的制备COPD大鼠模型进行研究发现，经黄芪多糖200～400 mg/kg治疗能够明显改善COPD大鼠精神状态、饮食、体质量及呼吸功能等一般生存状态；能够明显改善COPD大鼠肺组织整体状态，使其体积、色泽、表面光滑度及弹性等均明显改善；能够明显改善COPD大鼠肺组织肺小叶、肺间质、肺表面细胞等病理性改变，炎性细胞浸润状况明显改善；提示黄芪多糖对COPD大鼠具有一定的保护作用。

VE、PEP、FEV1以及FEV1/PEP是监测肺功能的常用指标。COPD将导致进入肺部的有效气体量减少，从而导致机体处于一种相对缺氧状态，进而引发动脉血氧分压降低、CO2分压升高以及低氧血症等一系列并发症［9］，所以血气分析指标（PaO2、PaCO2、pH）也能够间接反应机体肺功能。本实验研究发现，经黄芪多糖200～400 mg/kg 治疗能够明显提高 VE、PEP、FEV1 及FEV1/PEP比值，明显提高PaO2、PH并降低PaCO2，提示黄芪多糖具有改善COPD大鼠肺功能的作用。

炎症细胞因子IL-8、TNF-α在COPD炎症进程中发挥着重要作用［10］，Kim V 等［11］研究也认为 IL-8、IL-10、TNF-α是肺部炎症及COPD病理变化的重要生物标记物。其中IL-8、TNF-α是COPD气道炎症反应中构成炎症细胞因子网络的重要组成部分，能反映气道炎症的改变程度，在COPD的发病过程中起着关键作用［12］，而 IL-10 具有抑制炎症反应的生理学作用［13］。IFN-γ是一种调节细胞免疫功能的小分子多肽，IFN-γ能够通过刺激巨噬细胞而激活中性粒细胞、血管内皮细胞，进而导致蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡，从而参与COPD气道炎症的形成［14-15］。本实验研究发现，经黄芪多糖200～400 mg/kg治疗能够明显降低COPD大鼠肺组织 IL-8、TNF-α 含量并提高 IL-10、IFN-γ 含量，提示黄芪多糖具有抑制COPD大鼠炎症反应的作用。

综上所述，黄芪多糖具有抑制COPD大鼠肺组织损伤并改善肺功能的作用，其机制可能与调节炎症因子表达、抑制炎症反应有关。