HIF-1α、CD105及F-8RAg标染的MVD在子宫内膜癌中的表达及价值评价

王烈宏

子宫内膜癌是临床常见的恶性肿瘤之一, 是影响女性健康的重大疾病之一［1］。近些年, 对于子宫内膜癌的研究仍在不断深入, 子宫内膜癌的发病机制以及肿瘤的诱导因子成为了研究该病的关键之处［2］。CD105是一种是内皮细胞增生的最可靠的标志物［3,4］。它在癌灶内及癌灶瘤周高表达, 提示其在新血管生成的血管优先表达［5］。子宫内膜癌新生的血管上强烈的表达, 因此常作为判断肿瘤产生的一种特殊的标志物质［6］。HIF-1α是一种转录因子, 在细胞缺氧时产生。研究显示, 在一些恶性肿瘤以及组织癌变前过度表达, 并且该因子与肿瘤的转移, 能量的代谢密切相关。本文通过SP法对相应的抗原作为标记物标志物进行标记, 研究高原环境中CD105,F-8RAg和HIF-1α在子宫内膜中的表达, 并对其价值进行评价。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2015年7月～到2016年9月收治的子宫内膜癌患者48例作为子宫内膜癌组, 根据临床手术病理分期标准［7］, 患者中子宫内膜癌Ⅰ期22例, Ⅱ期14例,Ⅲ期7例, Ⅳ期5例。另选本院同期收治的子宫内膜不典型性增生11例(不典型性增生组)和正常子宫内膜患者12例(正常组)。所有研究对象的标本均经过病理学诊断确诊。

1. 2 检测方法 本次研究检测方法采用SP法, 所需的SP法试剂盒由北京中山公司提供, CD105、F-8RAg以及HIF-1α抗体由广州安必平医药科技股份有限公司提供, 具体操作按照步骤：①烤片：温度68℃, 时间20 min；②常规二甲苯脱蜡, 采用梯度酒精脱水法：二甲苯Ⅰ(20min)-二甲苯Ⅱ(20 min)-100%酒精Ⅰ(10 min)-100%酒精Ⅱ(10 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min)；③阻断：灭活内源性过氧化物酶：3%过氧化氢(H2O2)37℃, 孵育10 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次, 5 min/次；④抗原修复：在pH 6.0的0.01M枸橼酸缓冲液中煮沸, 温度95℃, 时间15～20 min, 然后自然冷却20 min 以上, 再用冷水冲洗, 加快冷却至室温, PBS冲洗3次, 5 min/次；⑤健康羊血清工作液封闭：温度37℃, 时间10 min, 倾去勿洗；⑥滴加一抗：4℃冰箱孵育过夜, PBS冲洗3次, 5 min/次(用PBS代替一抗作阴性对照), 滴加生物素标记二抗,在 37℃温度下孵育30 min,PBS冲洗3次, 5 min/次；⑦滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液：在37℃温度下, 孵育30 min, PBS冲洗3次,5 min/次；⑧二氨基联苯胺(DAB)/ H2O2反应染色：清水充分冲洗后, 用苏木素复染, 常规脱水、透明、干燥、封片。PBS代替一抗作阴性对照, 阳性对照片由试剂公司提供。

1. 3 观察指标及判定标准 MVD测定参照文献［8］的微血管计数方法：首先, 在40倍显微镜下观察全部视野, 在所有切片中, 选择邻近内膜增生程度最高或内膜癌侵犯最深的3个部位, 作为富含血管组织的“热点”区, 也是棕黄染色密度最高的区域, 然后, 在400倍显微镜下双盲法计数微血管,其中呈现单个或聚集的被染为棕黄色或棕褐色的内皮细胞,只要这些细胞和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开, 就把这些内皮细胞作为1个血管计数, 每次计数3个视野,取其均值作为MVD。管腔＞8个红细胞直径或管壁带有肌层的大血管不作为新生血管计数。HIF-1α蛋白以胞浆或胞核内有棕黄色细颗粒为阳性, 在400倍显微镜下对每张切片随机选择5个视野, 计数200个细胞视野, 共 1000个, 阳性细胞数＜1%为阴性“-”,阳性细胞数在1%～10%为弱阳性“+”,在11%～50%为中度阳性“++”, 若阳性细胞＞50%则为强阳性“+++”。

1. 4 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；相关性分析采用Spearman分析；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 三组CD105与F-8RAg标染的MVD结果比较 子宫内膜癌组和不典型增生组中, 用CD105与用F-8RAg标染的MVD呈显著正相关(r=0.653、0.597, P＜0.05), CD105标染的MVD明显高于F-8RAg, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；而正常组中, CD105标染MVD与F-8RAg比较差异无统计学意义 (P＞0.05)。见表 1。

2. 2 三组HIF-1α、CD105、F-8RAg阳性表达比较 子宫内膜癌组HIF-1α、CD105、F-8RAg阳性表达率均显著高于正常组和不典型性增生组, 且子宫内膜癌组HIF-1α阳性表达率随FIGO分期的升高而增加, 差异具有统计学意义 (P＜0.05)。见表 2。HIF-1α 与 CD105或 F-8RAg标染的MVD均显著相关(r=0.772、0.621, P＜0.05), 但与CD105标染的MVD相关性更强。

表1 三组CD105与F-8RAg标染的MVD结果比较( ±s)

表1 三组CD105与F-8RAg标染的MVD结果比较( ±s)

注：与本组CD105比较, aP＜0.05

组别 例数 CD105 F-8RAg t P正常组 12 4.13±2.42 4.52±2.41 -0.396 ＞0.05不典型性增生组 11 13.15±8.27 7.34±3.52a 2.144 ＜0.05子宫内膜癌组 48 25.65±7.37 12.43±3.71a 11.100 ＜0.05

表2 三组HIF-1α、CD105、F-8RAg阳性表达比较［n(%)］

3 讨论

子宫内膜癌是常见的恶性肿瘤之一, 与其他恶性肿瘤一样, 具有较高的致死率, 成为影响女性患者的重大疾病之一。常规对于子宫内膜癌的治疗多采用外科手术与放疗的方法［8］。对于恶性肿瘤来说, 治疗后复发以及转移的可能性极高。因此, 如何在治疗后尽可能降低并发症以及防止肿瘤的再次转移与复发, 成为了恶性肿瘤治疗的关键。对于不典型增生发展成为恶性肿瘤的几率较高, 作为子宫内膜恶性肿瘤的前身, 对于其的干预与防治也作为肿瘤治疗重要的一部分。

血管生成在恶性肿瘤的生长和发展中期重要作用, Akagi等［9］研究发现, 在结、直肠腺瘤中, 有轻、重度不典型增生性腺癌发展过程中, 用CD105标记的微血管密度值如果逐渐升高, 则提示异常, 这有助于早期诊断疾病, 说明CD105是血管内皮细胞增殖的标志之一, 与总内皮细胞标志物CD31、CD34等不同的是, CD105仅在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞中呈现强表达, 而在正常组织的血管中没有表达。Zagzag等［10］提出, 人类肿瘤细胞组织中HIF-1α的升高与肿瘤血管生成及肿瘤进展有明显相关, 在不同的肿瘤组织中,致癌基因所导致的传导通路的改变, 均通过HIF-1α表达升高促进肿瘤的生长, HIF-1α促进肿瘤生长的关键在于HIF-1α能促进肿瘤血管生成［11］。MVD是测量血管生成的定量指标, 研究中常用相应因子标染得到的MVD结果测定肿瘤的发生情况以及与肿瘤发生、生长代谢的相关性。CD105是一种标志物, 它在子宫内膜癌新生的血管上强烈的表达, 因此常作为判断肿瘤产生的一种特殊的标志物质。

HIF-1α是一种转录因子, 在细胞缺氧时产生, 众多研究显示［12-14］, HIF-1α在一些恶性肿瘤及组织癌变前呈现过度表达, 并且HIF-1α与肿瘤的转移, 能量的代谢等密切相关。在许多组织的缺氧微环境中均测定到其含量, 而在正常的组织其数量存在并不出现任何异常。根据这一指标对恶性肿瘤发生情况进行判断检测。研究显示, CD105、HIF-1α及F-8RAg可能共同参与了子宫内膜癌的发生。

分析文中数据可知, 子宫内膜癌组和不典型增生组中,用CD105与用F-8RAg标染的MVD呈显著正相关(r=0.653、0.597, P＜0.05), CD105标染的MVD明显高于F-8RAg, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；而正常组中, CD105标染MVD与F-8RAg比较差异无统计学意义(P＞0.05)。HIF-1α与CD105或F-8RAg标染的MVD均显著相关(r=0.772、0.621,P＜0.05), 但与CD105标染的MVD相关性更强。

综上所述, CD015在恶性肿瘤中参与心血管的形成,HIF-1α对血管的形成具有一定的促进作用, CD105的MVD与HIF-1α的表达与子宫内膜癌的发生密切相关。

［收稿日期：2018-02-27］