分子标记选择改良水稻两系不育系创5S稻瘟病抗性

廖常青，陈 英，向 聪，雷东阳*

（1湖南丰神农业科技有限公司，长沙 410000；2湖南农业大学农学院，长沙 410128）

稻瘟病是水稻生产中破坏程度最大的病害，目前已经成为影响水稻高产优质的重要因素之一［1］。用农药防治稻瘟病会造成环境污染和农药残留。目前，培育带有稻瘟病广谱抗性基因的水稻是防治稻瘟病最环保并且经济有效的方法［2］。但是稻瘟病的变异较快，抗稻瘟病品种在推广3～5年后，毒性菌株渐渐成为优势小种，最终使品种抗性丧失。主要是因为抗病品种所携带的抗病基因抗谱较窄，病害遇到易发病的环境时就会迅速蔓延［3］。因此，培育出性状优良的抗稻瘟病品种是育种专家追求的目标。

两系不育系创5S不育性较稳定，可恢复性较好，不育起点温度低，株型理想，配合力较强并且异交结实好［4］。由于稻瘟病生理小种近年来不断产生变异，导致创5S对稻瘟病的抗性逐步衰退。抗性基因的成功导入可以显著提高品种抗性和抗谱，而MAS是实现抗性基因导入和筛选的有效方法［5］。Pigm是一个广谱稻瘟病抗性基因，来源于持久抗稻瘟病品种谷梅4号，目前该基因已经被克隆，其抗性比公认的 Pi1，Pi2，Pi3／Pi5广谱抗性更加广泛［6］。江南［7］通过对 Pi40（t）进行抗谱分析，精细定位，最终将该基因精细定位于标记T3和CG5E－Pi2之间。本研究拟通过杂交、回交和分子标记辅助选择将IR65482中的广谱抗稻瘟病基因Pi40和谷梅4号中的广谱抗稻瘟病基因Pigm导入到水稻两系不育系创5S中，定向改良水稻两系不育系创5S，旨在培育出综合性状优良、具有持久抗性的水稻改良不育系，为抗病杂交水稻新品种的培育提供优良的抗性亲本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 技术路线

以两系不育系创5S为受体，通过与谷梅4号和IR65482两个供体亲本杂交，并以创5S作为轮回亲本连续回交直到BC3F1代。每次回交均筛选目标单株与轮回亲本回交，筛选到的目标单株须含供体抗性基因，且农艺性状与轮回亲本相似。BC3F2世代利用分子标记技术筛选携带纯合目的基因的单株，各个世代在利用分子技术选择目的基因的同时，筛选植株农艺性状接近轮回亲本的优良株系，最后对BC3F2株系进行稻瘟病抗性鉴定并与亲本进行农艺性状的比较（图1）。

图1 抗性改良技术路线图Fig.1 Technical roadmap for improved resistance to rice blast

1.2.2 基因型鉴定

据已有的研究基础［8，9］，挑选与目标基因 Pi40和Pigm紧密连锁的标记 Indel3、RM527、RM3330、ZJ58、RM7311对目标基因在受体亲本和供体亲本之间进行多态性筛选，目的是筛选到在亲本之间多态性较好的引物。

PCR总反应体系含0.2μmol／L正、反向引物各0.2μL、5μL 2×EasyTaqSuperMix、1μLDNA模板及3.6μLddH2O。引物RM527和 RM7311的PCR反应程序为：94℃预变性5 min后进行35个循环扩增，循环条件为 94℃变性 30 s，58℃复性 30 s，72℃延伸1 min，最后在72℃中延伸5 min，4℃下保存。PCR扩增产物在2%浓度下的琼脂糖凝胶上电泳分离，分离结束后放置于凝胶成像系统中，拍照并记录。

1.2.3 稻瘟病鉴定

改良株系的稻瘟病抗性鉴定在湖南省浏阳市大围山抗性鉴定圃进行。此地区属中亚热带季风湿润气候，7月平均气温28.9℃，海拔约400 m，空气湿度大，是稻瘟病高发区域。供试材料2017年5月8日播种，6月10日移栽，每份材料按照6行×8株单本插，株行距20 cm×25 cm，顺序排列，无重复，四周栽插对照感病品种CO39，9月下旬日进行稻瘟病抗性调查。叶瘟病级、穗瘟发病率、穗瘟损失率和穗瘟病级均按照国家标准进行记录。分蘖盛期调查叶瘟，求出加权平均值即为发病等级，收种前调查穗瘟发病率和损失率，调查穗数不少于80穗。稻瘟病抗性鉴定标准和方法采用综合指数法，即叶瘟病级、穗瘟发病率和损失率病级的加权指数（表1）。

表1 稻瘟病抗性评价综合指数Table 1 Composite index for blast resistance evaluation

1.2.4 农艺性状考察

零售企业配送中心建设首先要考虑配送中心的选址，考虑政策、地租、气候、与企业上下游的距离、交通、门店分布等各方面情况，综合考量采取重心法选择合适配送中心地理位置；接着投入大量的资金购买必要的物流设施和设备，必须建成完善的网络信息系系统；配送中心的建设需要软件硬件的配合，除了硬件设施、设备外，还需要员工具有现代化的物流职业素养，只有软硬件的默契配合才能够实现配送中心的合理运营。

将改良株系与轮回亲本创5S种植在相同条件的试验田中，随机选取创5S、各改良株系各15株（不取边行）。主要考察株高、单株穗数、剑叶长、剑叶宽、剑叶角度、穗长、每穗总颖花数、柱头外露率等性状。将亲本创5S作为对照，比较改良株系与亲本创5S的性状差异是否显著。

1.3 数据分析

采用DPS软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 多态性引物筛选

图2A中引物多态性筛选结果显示，RM7311在受体亲本创5S中扩增出的产物较大，而在供体亲本谷梅4号中扩增出的产物较小，受体和供体之间的PCR产物带型具有明显的多态性。表明RM7311在谷梅4号和创5S间具有较好的多态性，该标记能够有效地应用于各回交世代的分子标记辅助选择。

图2B中引物多态性筛选结果显示，RM527在受体亲本创5S中扩增出的产物较小，而在供体亲本IR65482中扩增出的产物较大，受体和供体之间的PCR产物电泳带型间差异明显。表明RM527在IR65482和创5S间具有较好的多态性，该标记能够有效地应用于各回交世代的分子标记辅助选择，并能筛选到含有目的基因的抗性单株。

Pigm、Pi40基因的连锁多态性分子标记及引物序列如表2所示。

表2 水稻稻瘟病抗性基因的连锁标记及引物序列Table 2 Linked markers of blast resistance gene and it’s primer sequences

图2 稻瘟病抗性基因引物筛选结果Fig.2 Primer screening result of rice blast resistance gene

2.2 分离世代株系基因型检测

利用多态性分子标记RM7311和RM527对不同回交世代群体进行基因型选择，在3个回交世代中，杂合带型与受体亲本纯合带型的基因型分离比例基本表现为1∶1。在改良过程中，需要有足够规模的基础群体，以确保能够筛选到综合性状优良且含有目的基因的不育系单株。

在回交世代群体BC3F1中，选择了6个农艺性状与受体亲本创5S相似的优良单株，其中含抗性目的基因Pigm的改良不育系3个（17S10、17S11和17S13），含抗性目的基因 Pi40的改良系 3个（17S16、17S18、17S19），自交获得 BC3F2代不育系种子，继续利用分子标记RM7311和RM527分别进行检测，部分植株的基因型结果如图3。

图3 利用Pi40和Pigm改良创5S稻瘟病抗性BC3 F2世代的分子检测结果Fig.3 Molecular test result of Improved Chuang 5S carrying Pi40 and Pigm in BC3 F2 Generation.

2.3 改良株系稻瘟病抗性鉴定

2017年夏季将创5S改良后代BC3F2代株系种植于大围山稻瘟病病圃进行田间抗性鉴定。结果表明，受体亲本创5S的叶瘟为5级，供体亲本谷梅4号为2级，IR65482为3级（表3）。利用谷梅4号改良创5S的3个不育系株系，17S10叶瘟为4级，17S11和17S13叶瘟为3级；其穗瘟病级3～5级，表现中等抗病至中感病，而创5S的穗瘟发病率为45.5%，表现感病，改良株系的穗瘟病发病率平均较创5S降低了74.8%，3个改良株系的穗瘟损失率平均较创5S降低了82.0%。3个改良株系的综合抗性指数2～2.8，所改良的3个株系的综合抗性指数均略低于谷梅4号，但较受体亲本创5S显著提高（平均提高了58.7%）。利用IR56482改良的3个不育系株系中，17S16、17S19叶瘟均为4级，17S18叶瘟表现为3级；其穗瘟发病率为8.0%～20.4%，穗瘟病级3～5级，表现中抗病至中感病，3个改良株系的穗瘟病发病率平均较创5S降低了73.0%；综合抗性指数为2.0～2.8，综合抗性稍弱于谷梅4号，但较受体亲本创 5S显著提高（平均提高54.0%）。

从表3可知，谷梅4号的综合抗性略强于IR65482，将谷梅4号中的抗性基因Pigm导入创5S后获得的改良系，其综合抗性基本上强于将抗性基因Pi40导入创5S后所获得的改良系。田间抗性鉴定结果表明，利用分子标记辅助选择技术对创5S的稻瘟病抗性改良是成功的。

表3 创5S改良后代BC3 F2株系的稻瘟病鉴定结果Table 3 Identification of rice blast resistance line of improved Chuang 5S

2.4 改良株系农艺性状考察

由表4可知，各改良株系基本保持了受体亲本的优良性状，部分性状甚至优于受体亲本创5S。利用谷梅4号改良创5S的3个不育系株系中，17S10农艺性状略优于对照创5S；17S11的单株穗数、剑叶角度和每穗总颖花数显著优于对照；17S13的穗数和每穗总颖花数等显著优于对照，但剑叶略长于对照。

利用IR65482改良的3个不育系株系中，17S16剑叶角度显著优于对照创5S；17S18剑叶角度显著优于对照，但剑叶略长于对照。

以上结果表明，在各株系中，含Pi40基因的改良系17S18不仅在抗稻瘟病性方面显著高于创5S，而且其他农艺性状与创5S相当。含Pigm基因的改良系17S11不仅抗稻瘟病性显著高于创5S，而且其他农艺性状已接近或优于创5S。

表4 改良不育系与亲本农艺性状比较Table 4 Com parison of agronom ical traits of im proved sterile lines w ith parents

3 讨论

由于稻瘟病对水稻的危害性极大，培育性状优良且抗稻瘟病的水稻品种成了育种家们追求的目标。随着生物技术的迅猛发展，分子标记技术等方法很大程度上促进了水稻遗传育种工作［10，11］。本研究利用分子标记技术结合田间表型鉴定和农艺性状选择，将抗病效果好的目的基因导入到生产上应用广泛但抗病性相对欠佳的两系不育系创5S中，在BC3F2世代筛选到了农艺性状与受体亲本创5S基本相似且含抗性目的基因的单株，这些改良不育系抗性较创5S有了显著提高，说明利用分子标记辅助选择技术改良水稻稻瘟病抗性是有效可行的，并证明了含有Pigm或Pi40基因的改良系稻瘟病抗性好，其中含Pigm改良系的抗性效果更佳。

但是在研究中发现，同一世代含相同抗性基因的不同改良系的田间抗性表型略有差异，如不育系改良系17S18含有Pi40基因，表现为抗稻瘟病，而改良系17S16和17S19表现为中抗稻瘟病。这种现象可能是由于谷梅4号对稻瘟病的抗性并不是只有Pigm起作用，很可能在Pigm附近还存在一些未被发现的与其紧密连锁的稻瘟病抗性基因，而在导入Pigm的过程中由于染色体遗传交换，那些未被发现的但发挥作用的抗性基因片段因此而丢失，造成遗传背景相同、抗性基因也相同的材料之间的抗性发生差异。

本研究结果表明，两系不育系创5S导入稻瘟病抗性基因Pigm和Pi40后得到的改良系稻瘟病抗性都有了显著提高。利用分子标记选择技术，初步创制出几个导入单个稻瘟病基因的改良系，为培育抗稻瘟病杂交稻新品种提供了抗性亲本材料，也为进一步培育持久、广谱的抗稻瘟病水稻新品种提供了优良的中间材料。