UPLC-MS/MS快速测定血浆中抗癫痫药物方法研究

麻佳蕾 许东航 陈菲（通讯作者） 吴筱丹

（1金华职业技术学院医学院 浙江 金华 321000）

（2浙江大学医学院附属第二医院 浙江 杭州 310052）

癫痫是临床常见的慢性中枢神经系统性疾病[1]，常用抗癫痫药物有苯巴比妥、苯妥英钠和丙戊酸钠等，且多为肝药酶诱导剂，多种抗癫痫药物联用则存在药物血药浓度增加或降低，从而带来多种不良反应[2-3]。本研究拟用超高效液相色谱串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）分析技术，建立快速检测人血浆中苯妥英钠和丙戊酸钠浓度的方法，为该类药物的个体化给药方案的制定、临床药物中毒判断等提供帮助。

1.材料与方法

1.1 仪器与试剂

所用仪器Agilient 6460三重串联四级杆液质联用仪；对照品：苯妥英钠（100210-201002）、丙戊酸钠（100963-201302），纯度：99.8%，均由中国食品药品检定所提供。

1.2 色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1×50mm，1.8μm），流动相为10mM醋酸铵和乙腈梯度洗脱，流速0.3ml/min，柱温40℃，进样量2μl。

1.3 质谱条件

电喷雾离子源，离子源温度120℃，用多反应监测（MRM）模式。苯妥英钠和丙戊酸钠Frag分别为70，16V，CE分别为12，18V，检测的离子对分别为m/z251.2→251.2，m/z143→143，负离子扫描分析。

1.4 标准溶液配制方法

配制药物对照品的混合储备液，在200μl空白血浆中，精密加入10μl对照品混合溶液，配制得对照液标准浓度范围见表1。标准溶液范围为 0.2μg•mL-1～ 20μg•mL-1。

1.5 血浆样品处理方法

量取血浆样品200μL，置于1.5mL塑料离心管中，涡旋混合30s，加入甲醇800μL，涡旋混合60s，4℃、1×104rpm离心30min，取上清液，进样2μL。

2.方法学考察

2.1 专属性

取6个不同来源的人空白血浆样品，混合均匀后取200μL，加入甲醇500μL，按血浆样品处理并进样分析。另配制苯妥英钠和丙戊酸钠质控血浆样品，得到空白血浆添加对照品色谱图，结果待测物峰形良好，分离效果佳，血浆内源性物质对待测物无干扰，保留时间分别为3.363和3.730min。

2.2 标准曲线与最低检出限

分别称取苯妥英钠和丙戊酸钠对照品适量，各加入甲醇，制成10.0mg•mL-1储备液。精密量取适当的标准储备液，制成系列混合对照品溶液。在200μL空白血浆中加入10μL混合对照品溶液，制成系列的质控血浆样品。按“1.5”项操作，以待测物质量浓度(X)为横坐标，待测物峰面积(Y)为纵坐标，其加权(1/X)线性回归后，得回归方程分别为：Y=2222.87X-49.88（R2=0.9984）；Y=121.17X-11.10（R2=0.9993）。

2.3 精密度和提取回收率

取空白人血浆，配制3个低、中、高质量浓度的质控样品，按血浆样处理方法进行处理。每质量浓度5份同日测定，连续测定3d。当日的随行标准曲线计算样品的测定质量浓度，与配制的质量浓度对照，得方法回收率。将质控样品的峰面积计算RSD，考察方法的日内、日间精密度，数值均＜15%，回收率均＞80%，结果见表1。

表1 抗癫痫药物的精密度和回收率

2.4 稳定性

考察抗癫痫药物化合物在低、中、高质量浓度分别于室温24℃放置8h、-20℃放置30天、-20℃反复冻融3次、处理后待测样品在仪器自动进样室10℃12h内的稳定性。结果峰面积RSD值均小于10%。

3.分析与讨论

3.1 色谱条件的优化

为获得较好的色谱峰峰形、较短的分析时间和较高的质谱响应信号，曾选择 0.1%的甲酸水溶液-乙腈、5mmol•L-1乙酸铵水溶液-甲醇及10mmol•L-1乙酸铵水溶液-甲醇作为流动相。结果以甲醇-5mmol•L-1乙酸铵为流动相梯度洗脱，回收率高，检测灵敏度最佳。

3.2 方法学应用

对服用抗癫痫药物的临床病人血液样本进行了分析，原检测报告单采用的是免疫发光法进行检测。具体检测结果见表2。

用本项目研究的UPLC-MS/MS方法与免疫发光法的结果基本一致。在病例样本检测出了丙戊酸钠的浓度。而在原来的分析报告中，未列出丙戊酸钠检测要求，因此在报告中未检测，导致临床诊断与病人的实际用药情况不想符合。

表2 服用抗癫痫药物的临床病人血浆样本检测结果（μg•mL-1）