甲状腺髓样癌中Rb和CyclinD1蛋白的表达及意义*

江 荷，刘 英，罗添友，江小林，唐 颖，李 丽，姜 勇Δ

1.四川大学华西医院 病理科·病理研究室(成都 610041)；2.四川大学华西医院 实验医学科(成都 610041)

甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)起源于甲状腺滤泡旁细胞，约占甲状腺恶性肿瘤的1%～2%[1]，但却导致了14%的甲状腺癌患者死亡[2]。 MTC侵袭性强，预后差，其5年、10年生存率分别为86%、65%[3]。确诊时约半数已发生淋巴结转移，约10%已发生远处转移，后者10年生存率仅40%左右[4]。MTC对放、化疗不敏感，主要治疗方法为手术治疗。目前虽有研究把肿瘤基因突变、降钙素水平和癌胚抗原视为髓样癌的独立预后因素[5]，但尚缺乏蛋白水平的有效预后标志物。Rb蛋白是由RB抑癌基因编码的一种长110 kd的周期蛋白，可抑制细胞生长及恶性转化，目前Rb蛋白应用于髓样癌的研究较少，且样本量也有限[6-7]。CyclinD1蛋白是由癌基因CyclinD1编码的一种周期蛋白，过量CyclinDl可致细胞生长失控并恶变，国内外有研究[8-9]报道了CyclinD1蛋白在甲状腺非髓样癌中过表达与肿瘤预后的关系[8-9]，但尚未见该蛋白在髓样癌中的表达研究。本研究采用免疫组化S-P方法检测106例MTC中Rb和CyclinD1蛋白表达情况，并分析两者相关性及其与临床病理特征和预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集四川大学华西医院病理科2010年1月-2016年12月确诊为MTC并行手术切除的病例，筛选有随访资料的106例病例进行分析。所有病例经两名病理医师复核切片并达成诊断共识。其中男38例，女68例。患者年龄11～82(45.7±12.08)岁。肿瘤最大直径3～80(25.8±8.03)mm。23例出现脉管癌栓(图1A)，40例出现被膜侵犯。64例出现淋巴结转移(图1B)。根据第8版AJCC髓样癌TNM分期[10]：I期+Ⅱ期61例，Ⅲ期+Ⅳ期45例。中位随访时间为51个月。

1.2 免疫组化方法及结果判读

采用免疫组化S-P法检测肿瘤组织中Rb和CyclinD1蛋白表达情况。Rb抗体(克隆号13A10 ，购自北京中杉金桥公司)，稀释浓度为1∶50;CyclinD1抗体(克隆号EP12，购自北京中杉金桥公司)，稀释浓度为1∶100。免疫组化遵照标准操作步骤进行，并设置空白、阴性及阳性对照。Rb及CyclinD1蛋白均表达在肿瘤细胞核内，棕黄色为阳性着色。参考文献[11]将Rb蛋白在肿瘤组织的表达分为Rb阳性(≥75%)(图1C)与阴性(<75%)。CyclinD1判读参考文献[12]设置的界限值，分为阳性(>10%)(图1D)及阴性(≤10%)。

图1 MTC的镜下表现及Rb、cyclinD1蛋白阳性表达

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Rb蛋白表达与MTC临床病理特征关系

84例(69.2%)Rb染色阳性，Rb蛋白低表达仅与癌栓形成与否有关(P<0.05)(表1)。通过单因素分析发现，Rb低表达与髓样癌低生存有关(P=0.02)(图2)。

2.2 CyclinD1蛋白表达与MTC临床病理特征的关系

76例(71.6%)CyclinD1染色阳性，CyclinD1表达与肿瘤直径、淋巴结转移和临床病理分期有关(P<0.05)(表1)。未发现CyclinD1蛋白高表达与MTC预后有关(P=0.79)。

表1 Rb、CyclinD1蛋白与MTC临床病理特征的关系

图2 MTC中Rb蛋白表达与预后的关系

2.3 Rb和CyclinDl蛋白表达的相关性分析

Rb与CyclinDl蛋白阳性表达之间存在正相关关系(r=0.453，P<0.01)(表2)。

表2 MTC组织中Rb蛋白和CyclinDl 蛋白表达的关系

3 讨论

3.1 MTC中Rb的表达与临床病理特征和预后的关系

Rb蛋白由RB基因编码，可抑制细胞生长，Rb功能缺失可导致细胞恶性转化。在小鼠模型中， Rb功能缺失将导致MTC的发生[13]。有研究[14]认为，该通路也许是人类MTC发生的潜在重要途径。有研究[6-7]表明，Rb在髓样癌中的表达率低于良性甲状腺肿瘤，但目前Rb蛋白运用于髓样癌的研究较少,而在甲状腺非髓样癌中研究较多。例如，Anwar等[15]研究提示，Rb蛋白在甲状腺恶性肿瘤中呈低表达现象。但Ferenc[16]等却发现，Rb蛋白在甲状腺滤泡癌中几乎全表达，同样Holm等[6]的研究也显示，Rb蛋白在甲状腺癌中未出现表达缺失。以上研究结果不同可能是判断Rb阳性的临界值不一样造成的。最近Anisley等[11]研究显示，Rb蛋白表达状态与髓样癌临床病理特征之间无关，但Rb低表达是MTC患者独立的预后因素。Rb低表达与预后不良的关系在胃腺癌[17]和肺非小细胞癌[18]中也被发现。本研究结果和上述文献一致，但和Valenciaga等[11]研究不一致，本研究还发现Rb蛋白低表达与脉管内癌栓之间关系显著，脉管内癌栓往往预示了肿瘤的转移，这也许是它和预后不良之间关联的解释。

3.2 MTC中CyclinD1的表达与临床病理特征和预后的关系

CyclinDl是重要的细胞周期蛋白之一， 它通过与蛋白CDK4/6结合形成CyclinDl-CDK4/6复合物，促使下游Rb蛋白磷酸化失活，致使与Rb结合的转录因子E2F获得释放，从而使细胞周期从G1期向S期转变。过量CyclinDl可致细胞生长失控及恶变，且提示肿瘤预后较差。CyclinDl过表达与许多恶性肿瘤的发生密切相关,包括头颈部基底细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等。有研究[19]表明，该蛋白在头颈部鳞癌中过表达提示预后不良，但在乳腺癌和肺非小细胞癌中过表达的意义尚存争议[18,20]。目前CyclinDl蛋白在甲状腺非髓样癌中的研究较多见，有研究[8-9]显示，CyclinD1蛋白的表达与甲状腺乳头状癌的临床病理分期、淋巴结转移及被膜侵犯有关，除此之外，刘珊等[8]和Basolo等[9]还发现甲状腺乳头状癌中CyclinDl表达水平与患者年龄有关。本研究中CyclinD1在MTC组织中的阳性表达与肿瘤直径、淋巴结转移和临床病理分期显著相关，而与患者年龄无关，与其在甲状腺乳头状癌中的研究结果基本一致。关于CyclinD1蛋白在MTC中的表达与预后的研究较少。Sporny等[21]仅发现，CyclinDl蛋白在髓样癌中表达阳性率高于在乳头状癌中的表达阳性率，但因纳入的髓样癌有限，未探究其与预后的关系。本研究单因素分析提示，CyclinD1阳性表达与髓样癌预后无关。到目前为止，CyclinD1在其他部位恶性肿瘤预后中扮演的角色不一，有待继续探讨。如 Brambillae等[22]研究提示，在肺腺癌中发现CyclinD1表达状态与生存率无关，但在卵巢浆液性癌中的研究表明，CyclinD1过表达与患者的低生存率有关[12]。

3.3 MTC中Rb、CyclinD1表达的相关性

许多基因参与了MTC的肿瘤发生。Rb基因功能丧失将导致肿瘤细胞恶性增殖，而CyclinDl在细胞周期调控过程中也发挥着重要作用，它可以调节Rb蛋白磷酸化。本研究对MTC中CyclinD1和Rb表达进行了相关性分析，结果显示两者阳性率呈一定的正相关性(r=0.453，P<0.01)。先前有研究[21]显示，在肺非小细胞肺癌中CyclinD1过表达与Rb蛋白表达呈正相关关系,两者出现正相关关系的可能原因是，CyclinD1蛋白在其他Rb家族基因(如Rb2、Rb3)中也有特定靶点，从而掩盖了单一的分子贡献。在本研究中，CyclinD1过表达而Rb表达阴性的病例只有7例。 Ferenc[16]和Basolo等[9]在分析CyclinD1和Rb蛋白在甲状腺滤泡癌中的表达时发现，CyclinD1与Rb蛋白表达无关，得出上述不同结论的原因可能是：研究样本数量少；CyclinD1和Rb的调节会受到其他因素(如p16、CDKs)影响。

综上所述，Rb蛋白在髓样癌中的低表达与癌栓形成有关， Rb蛋白低表达是MTC的预后因素。CyclinD1蛋白在MTC的表达与肿瘤直径、淋巴结转移和临床病理分期有关，但该蛋白不是MTC的预后因素。在MTC中CyclinD1和Rb表达阳性率呈正相关，其原因有待进一步探讨。Rb蛋白可作为MTC总生存率的预测指标。