初步探讨石蜡标本制备方案的选择及ALK2在小鼠牙胚中的表达

张雪 赵欢 李媛 张琦 胡月 史册 孙宏晨

牙作为人体最硬的组织，提供咀嚼、支持、发音、维持面部形态等功能。龋坏、酸蚀、外伤等可造成牙体缺损甚至缺失，影响咀嚼、消化、美观，造成关节紊乱等[1]。随着实验技术手段的提高和牙相关疾病研究的深入，小鼠动物模型成为研究模拟人类牙发育相关疾病发生的不可缺少的一部分，利用转基因技术，建立基因敲除或基因过表达等动物模型[2]，探讨牙发育调控机理。小鼠牙胚标本的制备是小鼠牙胚实验研究的前期重要步骤。组织的固定、脱水以及石蜡包埋等步骤的条件是影响切片质量和染色质量的关键。

牙发育始于牙胚上皮和间充质相互作用，牙乳头在成釉器内釉上皮的刺激下，形成成牙本质细胞，成牙本质细胞再矿化形成牙本质，而内釉上皮在牙本质的刺激下形成成釉细胞，成釉细胞分泌基质形成釉质[3]。多种信号通路参与牙发育，主要包括骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、WNT、SHH(sonic hedgehog)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)信号通路[4]等。研究发现，BMP信号通路异常导致牙胚发育停留在牙板期/蕾状期[5]，而BMP信号增强又可促进修复性牙本质的形成[6]。

BMP信号通路的激活需要受体的激活以及下游信号的传导[7]。BMP受体包括Ⅰ型和Ⅱ型受体[8]。BMP和受体结合后，主要依赖Ⅰ型受体的GS偶联区激活下游的SMAD1/5/8，从而发挥信号传导的作用[7]。Ⅰ型受体包括ALK3(activin receptor like kinase 3)、ALK6(activin receptor like kinase 6)和ALK2(activin receptor like kinase 2)[7-8]。研究发现，ALK3基因敲除可导致牙发育迟缓[9]，ALK6敲除对牙发育无明显影响，而关于ALK2在牙发育中的作用却未见报道。为了初步探讨ALK2在牙发育中的作用，我们利用免疫组化技术检测ALK2蛋白在牙发育中的表达分布。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

C57/BL6小鼠(吉林大学动物实验室提供)，PBS(ZL1-9062, 中杉金桥)，多聚甲醛、乙醇、二甲苯、苏木素及伊红Y 染色液(北京化工有限公司)。ALK2抗体(Abcam，ab60157)，免疫组化试剂盒(No.9706，博迈德);DAB(ZL1-9019，中杉金桥);体视显微镜(SZX16)、电子显微镜(vanox，Olympus，日本)。

1.2 胚龄的确定及不同胎龄小鼠牙胚的制备

将2 月龄的雌鼠和雄鼠合笼，以发现阴栓为准，记为E0.5。分别于E12.5、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E17.5和E18.5，脱颈处死孕鼠，暴露腹腔，可见串珠状的胚胎位于子宫内，取出子宫及胚胎，立即放在预冷并新鲜的4%多聚甲醛中，4 ℃固定过夜。流水冲洗后，按流程脱水(表 1)，浸蜡包埋。

1.3 牙胚石蜡切片及HE染色

将蜡块常规切片(切片厚度3 μm)，经二甲苯脱蜡至水，苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin，HE)，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.4 免疫组织化学染色

取E18.5的胚胎，按上述方案石蜡包埋、切片，进行免疫组化染色。具体步骤为：脱蜡至水，胰酶修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶后，兔抗鼠ALK2抗体4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3×5 min;滴加生物素标记二抗, 37 ℃孵育10 min, PBS冲洗3×5 min; 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素生物素工作液，37 ℃孵育20 min, PBS冲洗3×5 min;DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，树胶封片。

1.5 统计学分析

表 1 不同时期牙胚脱水过程及脱水时间

2 结 果

2.1 小鼠胚胎大体形态

通过体视显微镜观察，E14.5的胚胎较小，后颈部突出，头部和眼球轮廓已出现，四肢包绕在未成形的皮肤中，肝脏较大，呈鲜红色。此时，皮肤发育基本完成，手掌、脚掌已独立出来，具有小鼠的基本形态(图 1)。

图 1 小鼠胚胎大体观

2.2 脱水时间调整前后牙胚切片比较

文献中报道的脱水时间较长[10]，为了提高实验效率，我们适当缩短了脱水时间(表 1)。研究可以发现调整后E16.5的牙胚切片完整无裂痕，HE染色清晰，2 组牙胚形态无差异(N=5，P>0.05)。这说明，调整后的牙胚脱水时间合理且规范(图 2)。

图 2 不同脱水时间的E16.5牙胚形态 (HE，×10)

Fig 2 HE staining of different dehydration times for E16.5 dental germ (HE，×10)

2.3 小鼠胚胎期牙胚发育过程

HE染色显示，小鼠牙发育始于E12.5，此时，上皮增厚；在E13.5，增厚的上皮向间充质延伸，似花蕾状，为蕾状期[3]；在E14.5，上皮继续向间充质延伸，呈帽状包绕部分间充质，为帽状期[3]；在E16.5，牙胚发育至钟状早期，成釉器分为四层，从内向外依次为内釉上皮、中间层、星网状层、外釉上皮，其中，中间层的细胞核居中，形态不明显[3]；在E18.5，牙胚发育至钟状晚期，中间层细胞间隙变大(图 3)。

2.4 ALK2在牙胚中的时间和时空表达

免疫组化染色显示，ALK2在阳性对照组织(人肝癌组织)中广泛表达，不仅表达于细胞膜，也表达于细胞浆。在牙胚中，我们发现， ALK2在牙胚蕾状期、帽状期的口腔上皮和间充质中都有表达。钟状期时， ALK2不仅在成釉器中表达，也在牙乳头中广泛表达(图 4)。

图 3 牙胚HE染色

3 讨 论

3.1 小鼠胚胎固定液的选择，脱水和透明时间的确定

众所周知，标本固定不仅可尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，也可凝固细胞自身蛋白，防止酶反应，发生自溶现象，又最大量的保留mRNA和蛋白[11]。常用的固定液见表2，其中，4%多聚甲醛可保留完整蛋白质，mRNA固定效果好，非特异性染色低，是较为理想的固定液(表 2)。

固定后的脱水是影响标本质量的一个重要环节，若脱水不足，影响浸蜡；脱水过度，影响切片。组织脱水原则有：①充分脱水又不过脱；②梯度脱水；③组织依赖性，如，肝脾等组织，由于组织较脆，含血较多，一般脱水要快，防止脱水过度[12]；而脑组织由于含有大量的脑磷脂需要较长的脱水时间，以防脱片[13]。因此，参考之前的文献，我们结合牙胚的组织特异性，摸索并制定出符合牙胚脱水的方案。

实验显示，该方案所选择的固定液合适，所设计的脱水时间合理。与以往的脱水方案相比，本方案在保证切片和染色质量的基础上，缩短了实验时间，提高了实验效率。本方案为牙胚发育生物学的高效研究提供了良好的技术支持和参考。

3.2 ALK2在牙胚中的作用

ALK2广泛地表达于机体的不同组织，如骨、软骨、心脏等[14]。研究表明， ALK2基因敲除后，小鼠出现下颌骨发育不全和心脏功能障碍[15]；而ALK2基因构成性活化可导致进行性纤维骨化症(fibrodysplasia ossificans progressiva ,FOP)，表现为异位骨化[14]。这说明，ALK2在不同组织器官中具有不同的生理功能，而ALK2在组织中的表达是研究其功能的基本和必要条件。因此，我们拟初步利用免疫组织化学染色技术检测ALK2在牙发育中的表达，从而探讨ALK2在牙发育中的作用[16]。

表 2 各种常见固定液的信号强度、背景染色及RNA保留能力的比较

Tab 2 Comparison of signal intension, background staining and RNA reservation ability among usual fixatives

固定剂信号背景RNA保留多聚甲醛(4%)100100100中性福尔马林4510046Zenker(秦克)100600110Boutin固定液6010077Carnoy(卡诺)4010033

免疫组化结果显示：①ALK2在蕾状期的口腔上皮中就有表达；②ALK2在帽状期的口腔上皮和间充质中均有表达；③ALK2在成釉器的内釉上皮、中间层、星网状层和外釉上皮中均有表达；④ALK2在牙乳头中广泛表达；⑤ALK2在牙发育中从蕾状期至钟状晚期持续性表达。这提示我们：①ALK2在牙发育早期可能发挥作用，调控牙发育的起始；②ALK2可能调控上皮-间充质相互作用，影响牙本质和釉质的形成；③ALK2可能在牙发育蕾状期至钟状期持续性影响牙发育。

综上，本研究表明，ALK2在牙发育早期就有表达，且持续表达于整个牙发育过程，我们推测了ALK2在牙发育中的可能性作用。然而，ALK2对牙本质形成的作用以及间充质中ALK2对內釉上皮分化的影响等机理研究仍有待探讨。