电针足三里穴对肠易激综合征大鼠平滑肌收缩蛋白vimentin的影响

刘娇萍，杨大业，冉国平，刘嘉颖，李 佳*

（1.湖北中医药大学基础医学院/华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院中西医结合肿瘤科，430051；2.湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉 430061）

肠易激综合征（Ⅰrritable Bowel Syndrome，ⅠBS）是一种感觉动力失调，以对机械性或化学性刺激的高敏感性（即高反应性或易激性）为特征的慢性肠道功能紊乱性疾病，因其发病率高、治疗困难、严重影响患者生存质量而被逐渐重视[1]。目前研究认为，肠易激综合征主要表现在[2]：胃肠功能紊乱、肠道高敏感性、神经递质失衡。针灸防治功能性胃肠疾病有良好的疗效，特别是针灸对胃肠动力的调整作用更是研究的热点之一[3]。近年来的研究逐渐证明，平滑肌肌动蛋白聚合和解聚、细胞骨架波形蛋白（vimentin）的重组与平滑肌细胞收缩动力学过程关系密切，并且研究发现，

vimentin可以调控炎性机制。足三里乃胃之下合穴，亦是足阳明胃经的合穴，乃治疗脾胃疾病的要穴，临床常用之治疗胃肠疾病。基于此，我们以平滑肌细胞骨架蛋白vimentin为切入点，以肠易激综合征模型大鼠为研究对象，探讨针刺对胃肠道平滑肌收缩动力以及炎性损伤的影响，为“肚腹三里留”的科学内涵提供实验依据，进一步揭示和丰富经穴-脏腑相关性。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 三月龄SPF级雌性SD大鼠80只，适应性喂养1周后，随机分为4组，正常组、模型组、穴位组、非穴位组，每组各20只。动物喂养在湖北中医药大学实验动物中心完成，生产合格证号：SCXK（鄂）2004-0007，环境温度21～25 ℃，湿度40%～60%。光照时间每日12 h，大鼠可自由取食饮水。

1.2 主要仪器、器材和试剂 BⅠO-RAD化学发光成像系统、XMTD-204恒温水箱、Milli-Q Direct超纯水机、ⅠMS-20全自动雪花制冰机、Powerpac Tm HC电泳仪、Trans-Blot SD Cell转膜仪、vimentin和GAPDH抗体、G6805-Ⅱ型电针治疗仪、0.30 mm×13 mm毫针。

1.3 模型制备 单一方法建立的模型常有局限性，两种或以上方法联合复制模型符合发病机制与临床表现。所以我们以高乳糖饲料喂养与束缚应激相结合的方法制备ⅠBS-D大鼠模型，参照文献方法[5]加工高乳糖饲料，略作改进进行束缚应激。采用捆绑器每天捆绑大鼠，固定于高铁架上并倾斜60°放置，使大鼠双后肢完全制动，1 h后解除束缚，造模共14 d，此造模方法采用相对温和的应激刺激结合外周致敏法同时使用，大大提高了造模的成功率。正常组常规喂养，束缚应激同模型组，其余各组于造模的同时给予相应的处理。

1.4 干预方法 参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱，穴位组选取双侧后三里穴，即实验大鼠的足三里穴。用0.30 mm×13 mm华佗牌毫针直刺，接G6805-Ⅱ型电针治疗仪，连续波，频率120次/min，强度1 mA，以大鼠双下肢轻微抖动为宜，留针15 min，1次/d，共14 d。非穴位组选取足三里穴外侧5 mm区域作为针刺点，干预方法同电针组。

1.5 指标检测 1）结肠蠕动波测定：依据相关报告[6]进行测定，1%戊巴比妥钠尾静脉注射麻醉大鼠，将自制的结直肠扩张刺激球囊插入大鼠肛门内，记录单位时间（30 min）内的结肠蠕动波个数。2）小肠黏膜组织炎性因子检测：剖开腹腔，摘取小肠，纵向剪开，0 ℃生理盐水清洁冲洗，刮取黏膜组织，- 70 ℃低温冰箱储存备用。酶联免疫吸附法（ELⅠSA）定量检测目的蛋白含量，检测指标包括ⅠL-1β、ⅠL-10。3）相关蛋白检测：蛋白免疫印迹法检测指标包括vimentin和内参GAPDH。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，对于正态分布数据采用方差分析和t检验，非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验，率的显著性比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 针刺对各组大鼠肠蠕动波的影响 见图1。

图1 各组大鼠30 min肠蠕动波计数总量注：NC：正常；Model：模型；RA：穴位；SA：非穴位。各组30 min大鼠肠蠕动波计数总量比较，模型组与非穴位组大鼠蠕动波次数明显高于正常组（*P＜0.05），而穴位组与模型组和非穴位组比较，蠕动波减少，差异具有统计学意义（# P＜0.05）。

2.2 针刺对肠易激综合征结肠黏膜组织炎性因子的影响 见图2。

图2 各组大鼠结肠黏膜ⅠL-1β和ⅠL-10的含量注：模型组大鼠结肠ⅠL-1β较正常组高，而 ⅠL-10 较正常组低，相比具有显著性差异（* P＜0.05）；经电针足三里穴治疗后，与模型组、非穴位组相比，结肠黏膜组织中ⅠL-1β降低，ⅠL-10增加，差异具有统计学意义（# P＜0.05）。

2.3 针刺足三里穴对肠易激综合征结肠组织中vmentin的表达 见图3。

图3 各组大鼠结肠组织中vimentin的表达注：针刺足三里穴促进ⅠBS结肠组织中vimentin的表达，与模型组、非穴位组相比，差异具有统计学意义（# P＜0.05），而非穴位组对vimentin没有影响。

3 讨论

中医学无肠易激综合征之名，根据其反复腹泻或便秘，或腹泻和便秘交替等主症，散见于中医学“腹痛”“泄泻”“下利”“飨泄”“便秘”“滞下”等范畴的文献中。国家标准《中国临床诊疗术语》明确肠易激综合征病名为“肠郁”。《素问·阴阳应象大论》：清气在下，则生飨泄，浊气在上，则生䐜胀。腹泻型肠易激综合征多为脾虚气滞，运化失职，肝郁气滞，津液无制而发泄泻[7]。治疗上当宜健脾补虚，行气。气得行则大便自调，脾气旺则津液自行，则泄泻得解。而且脾虚泄泻临床常见，且反复发作，缠绵难愈。从本虚标实论治，重补虚行气。基于此，我们选取调节胃肠功能的足三里穴，固护后天正气，调节胃肠功能。

排便习惯及大便性状的改变是肠易激综合征的主症，而胃肠动力学异常和炎性损伤一直是肠易激综合征病理生理研究的重点。虽然功能障碍的表现呈显著的广泛性，甚至可能涉及整个胃肠道，但结肠本身的运动功能紊乱仍然是肠易激综合征的一个重要特征。因此，结肠功能的紊乱可作为研究肠易激综合征的切入点。胃肠道疾病发病机制中，消化道平滑肌细胞收缩异常，细胞表型发生改变，从而引起细胞骨架蛋白一系列的变化。而机体内分化成熟的平滑肌细胞与心肌细胞、骨骼肌细胞不同，具有可塑性，能够在一定的条件下发生表型转化，从收缩型平滑肌细胞去分化为合成型平滑肌细胞，进而合成多种细胞因子、介质及细胞外基质等参与炎症和消化道重建；与此相应，平滑肌细胞由生理状态下的“收缩型”转化为“合成型”，一些分化标志物表达明显下调甚至消失，细胞骨架发生重塑，细胞处于去分化状态，从而丧失收缩功能。由此可见，平滑肌细胞的表型转化与平滑肌收缩功能和炎症反应密切相关。而且相关研究表明，早期的炎症反应可能是平滑肌细胞功能失调的诱因，进而引起腹泻型为主的肠易激综合征结肠运动[8]。

参与炎症反应的粘附分子、趋化因子、细胞因子、炎症介质等都是NF-κB的靶基因，包括细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、单核细胞趋化因子-1、白细胞介素 -1（Ⅰnterleukin-1，ⅠL-1）、ⅠL-6、ⅠL-8、ⅠL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-a）等。ⅠL-10是一种抑制性的细胞因子，具有抗炎、免疫抑制活性。ⅠL-1β能增加由巨噬细胞产生的细胞因子如ⅠL-6、ⅠL-10和TNF-a，使中性粒细胞向炎症部位募集，引起一系列肠道病变，从而导致平滑肌细胞的增生异常。而肠道炎症时增生异常的平滑肌细胞会导致平滑肌肌层变薄，以致平滑肌运动异常。所以，ⅠL-1β和ⅠL-10不仅能反映炎症，在一定程度上也反映肠道平滑肌运动功能变化[9]。

中间丝是真核生物细胞的特征性结构，与微管、肌动蛋白微丝组成细胞骨架Vimentin属于中间丝蛋白的一种，其主要附着在细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端，在支撑及锚固细胞器方面具有重要作用，同时它还能够维持细胞形状、细胞质完整性及稳定细胞骨架内的相互作用[10]。平滑肌细胞内F-actin与vimentin均形成丝线状的微丝，沿同一方向排列有序而又相互交错的分布于细胞质，在胞质外围靠近细胞膜处密集排列[11]。近年来的研究逐渐证明，平滑肌肌动蛋白聚合和解聚、细胞骨架波形蛋白vimentin的重组，平滑肌细胞收缩动力学过程与这两种功能的行使有密不可分的关系[12-14]。而且我们最近的研究也发现[15-16]，平滑肌细胞骨架调节蛋白引起vimentin的磷酸化从而影响该蛋白的重组，进而调节平滑肌细胞收缩[17-18]。但之前对其在炎症方面的作用研究较少，有实验表明，波形蛋白能够影响调控平滑肌细胞炎性小体形成及活性[19]。Vimentin通过不同途径调控着细胞多种功能，与类风湿关节炎、白内障、丙型肝炎以及肿瘤的发生发展相关[20]。我们实验证实，针刺可以有效抑制肠易激综合征模型平滑肌细胞收缩蛋白vimentin的表达，减少炎症反应，从而对胃肠收缩以及炎症机制有调节作用。