超声波-湿热法结合酸水解制备大米抗性淀粉及其理化性质研究

杨 帆 肖华西 林亲录 张 倩 王素艳 罗非君 叶 雅

(中南林业科技大学食品科学与工程学院, 长沙 410004)

抗性淀粉(resistant starch，RS)是指不被健康人体小肠吸收的淀粉及其分解物的总称[1]，具有良好生理功能，可抑制餐后血糖快速升高，减少血清中胆固醇和甘油三酸酯的量，并能有效促进肠道中有益菌的生长和繁殖[2-5]。尽管RS的种类很多，但RS1和RS2由于性质不稳定会在加工过程中造成大量损失，而RS3却是淀粉经糊化后由于老化(回生)作用而形成的一类特殊的淀粉结构[6]，因此RS3有较高的开发利用价值，并引起了人们的普遍关注。目前，大米RS3型抗性淀粉制备方法主要有酸变性和水热处理[7]、酶法处理[8]和压热处理[9]等，这些单一处理使大米淀粉整体降解性差，RS3得率普遍偏低。本研究采用超声波-湿热法结合酸水解制备大米RS3型抗性淀粉，通过优化实验选出最佳工艺条件，为RS3的工业化生产提供一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 原料

东北粳米淀粉：无锡市天之源食品有限公司，抗性淀粉约占0.67%。

1.2 试剂

无水乙醇(分析纯)：天津市富于精细化工有限公司；氢氧化钠、氢氧化钾(均为分析纯)：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；柠檬酸(食品级)：潍坊英轩实业有限公司；氯化钾(分析纯)、顺丁烯二酸(化学纯)、二水氯化钙(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸(分析纯)：湖南汇虹试剂有限公司；抗性淀粉检测试剂盒：上海超研生物科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

101C-2AB电热恒温鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；400T多功能粉碎机：铂欧五金厂；DZKW-4恒温振荡器：常州澳华仪器有限公司；FS-250超声波处理器：上海生析超声仪器有限公司；L530台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；722 s可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；Super4 RVA快速黏度分析仪：澳大利亚Newport Scientific仪器公司；Multizoom AZ100/AZ100M多功能显微镜：尼康仪器(上海)有限公司；湿热反应罐：实验室自制。

1.4 方法

1.4.1 超声波-湿热法制备RS3

1.4.1.1 制备工艺

称取一定量的大米淀粉，加入适量蒸馏水，配成不同浓度的淀粉悬浮液，将该大米淀粉悬浮液在沸水浴中搅拌糊化60 min，在40 ℃下，用超声波发生器产生的100 W的超声波处理30 min，放入自制湿热反应罐中密闭平衡24 h，调节烘箱温度，烘烤一定时间，取出冷却至室温后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨过100目筛。

1.4.1.2 单因素实验设计

选择影响RS3得率的3个主要因素:含水量、反应温度、反应时间。

1)含水量对RS3得率的影响。称取20 g大米淀粉，加入适量蒸馏水，使其含水量分别为20%、25%、30%、35%、40%，将大米淀粉悬浮液在沸水浴中搅拌糊化60 min，在40 ℃下，用超声波发生器产生的100 W的超声波处理30 min，放入自制湿热反应罐中密闭平衡24 h，移入烘箱中，110 ℃烘烤10 h，取出冷却至室温后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨过100目筛, 测定各样品的RS3含量。

2)反应温度对RS3得率的影响。称取20 g大米淀粉，加入适量蒸馏水，使其含水量为25%。将该大米淀粉悬浮液在沸水浴中搅拌糊化60 min，在40 ℃下，用超声波发生器产生的100 W的超声波处理30 min，放入自制湿热反应罐中密闭平衡24 h，移入烘箱中，温度分别设置为100、110、120、130、140 ℃，烘烤10 h，取出冷却至室温后于 4 ℃冷藏24 h，烘干，研磨过100目筛, 测定各样品的RS3含量。

3)反应时间对RS3得率的影响。称取20 g大米淀粉，加入适量蒸馏水，使其含水量为25%。将该大米淀粉悬浮液在沸水浴中搅拌糊化60 min，在40 ℃下，用超声波发生器产生的100 W的超声波处理30 min，放入自制湿热反应罐中密闭平衡24 h，移入烘箱中，在110 ℃分下别烘烤8、10、12、14、16 h，取出冷却至室温后于 4 ℃冷藏 24 h，烘干，研磨过100目筛, 测定各样品的RS3含量。

1.4.1.3 正交实验设计

在单因素实验基础上，每个因素各选出3个水平，采用3因素3水平正交实验 L9(34)，以确定最佳工艺条件。

1.4.2 超声波-湿热法结合酸水解制备RS3

1.4.2.1 制备工艺

称取20 g大米淀粉，加入适量蒸馏水，使其含水量为30%。将该大米淀粉悬浮液在沸水浴中搅拌糊化60 min，在40 ℃下，用超声波发生器产生的100 W的超声波处理30 min，放入自制的湿热反应罐中密闭平衡24 h，移入烘箱中烘烤,在130 ℃下烘烤10 h，取出冷却至室温后于 4 ℃冷藏 24 h，加入一定浓度柠檬酸混匀，放入100 ℃的水浴锅中加热一定时间，冷却置于4 ℃的冰箱老化一定时间，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨过100目筛，用去离子水洗涤5遍，弃去上清液，将沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨过100目筛。

1.4.2.2 单因素实验设计

在超声波-湿热法制备RS3实验的最佳工艺条件基础上，综合考察和分析了各影响因素在酸水解过程中对RS3得率的影响，确定以酸的浓度、加热时间、老化时间为主要考察因素进行单因素实验。

1)酸的浓度对RS3得率的影响。样品经最佳超声波-湿热法条件处理后，分别加入浓度为0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L的柠檬酸溶液，按淀粉∶酸为2∶3的比例在100 mL烧杯中混合均匀。将混合物放置于100 ℃的恒温水浴锅中加热搅拌20 min，冷却至室温后置于4 ℃的冰箱老化36 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨过100目筛，用去离子水洗涤5遍，弃去上清液，将沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨过100目筛, 测定各样品的RS3含量。

2)加热时间对RS3得率的影响。样品经最佳超声波-湿热法条件处理后，加入浓度为0.15 mol/L的柠檬酸溶液，按淀粉∶酸为2∶3的比例在100 mL烧杯中混合均匀。将混合物放置于100 ℃的恒温水浴锅中分别加热搅拌10、15、20、25、30 min，冷却至室温后置于4 ℃的冰箱老化36 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨过100目筛，用去离子水洗涤5遍，弃去上清液，将沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨过100目筛, 测定各样品的RS3含量。

3)老化时间对RS3得率的影响。样品经最佳超声波-湿热法条件处理后，加入浓度为0.15 mol/L的柠檬酸溶液，按淀粉∶酸为2∶3的比例在100 mL烧杯中混合均匀。将混合物放置于100 ℃的恒温水浴锅中加热搅拌20 min，冷却至室温后置于4 ℃的冰箱中分别老化12、24、36、48、60 h，移入35 ℃的烘箱中烘48 h，研磨过100目筛，用去离子水洗涤5遍，弃去上清液，将沉淀放入35 ℃的烘箱中烘24 h，研磨过100目筛, 测定各样品的RS3含量。

1.4.2.3 正交实验设计

在单因素实验结果的基础上，对每一种影响因素筛选3个水平，进行正交实验，以确定最佳的工艺条件。

1.4.3 RS含量的测定

参照抗性淀粉试剂盒说明书中的方法进行测定[10-11]。

抗性淀粉的质量分数=ΔE×F/W×0.1×0.9×100%

式中：ΔE：空白试剂的吸光度值；F：D-葡萄糖含量除以D-葡萄糖的吸光度值；W：样品质量/g。

1.4.4 大米抗性淀粉的理化性质的测定

1.4.4.1 含水量测定[12]

式中：m0：称量瓶的质量/g；m1：称量瓶和试样的质量/g；m2：称量瓶和试样干燥后的质量/g。

1.4.4.2 溶解性测定

将淀粉悬浮液在30 ℃的水浴锅中搅拌30 min，在3 000 r/min的转速下离心15 min，弃去上清液，将沉淀在105 ℃下烘干称重，即得水溶淀粉的质量。

式中：X0：淀粉样品干质量；X1：水溶淀粉质量。

1.4.4.3 膨润力测定

按照1.4.4.2中的方法，所得沉淀为膨胀淀粉，称其质量即为膨胀淀粉的质量。

式中：X0：淀粉样品干质量/g；X1：水溶淀粉质量/g；X2：膨胀淀粉质量/g。

1.4.4.4 糊化性质测定

采用RVA快速黏度分析仪测定：样品含水量在14%时，称取3 g样品，加入到装有25.0 mL蒸馏水的铝罐中，按此标准根据样品水分含量称取准确的样品量及蒸馏水。参数设置由Thermocline for windows软件控制。

1.4.4.5 偏光显微镜观察

将少量淀粉悬浮于1 mL去离子水中，吸取一滴淀粉溶液滴在载玻片上，轻轻将盖玻片盖上，将气泡赶出。选择合适的物镜及放大倍数对抗性淀粉和原大米淀粉进行偏光十字和形态进行观察。

1.4.5 数据处理

实验数据重复3次，采用 Origin、SPSS statistics软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 超声波-湿热法制备RS3最佳工艺条件

2.1.1 单因素实验结果

如图1所示，淀粉含水量、反应温度、反应时间不同，RS3的得率也不同。超声处理对淀粉产生“空化效应”，在高温高压下加剧淀粉分子与溶剂分子间的摩擦，使直链淀粉、支链淀粉溶出，导致淀粉链破裂，有利于生成抗性淀粉。后经湿热处理，RS3的得率在含水量为25%时最大，其后随淀粉含水量增大而减小。这主要是因为当含水量低于25%时，整个体系的黏度很低，直链分子之间彼此接触的概率小；当含水量大于25%时，淀粉糊的黏度很大，没有足够的水分子进入淀粉的结晶区，氢键破坏不完全，淀粉分子难以充分糊化，阻碍了直链淀粉分子相互接近并形成结晶，不利于RS3的形成[13-14]。湿热处理的温度是影响RS3得率的主要因素之一。当温度为110 ℃时RS3得率达到最大，高于110 ℃之后，RS3得率开始减少。高温为淀粉分子提供了大量的能量，有利于淀粉分子链的迁移，冷却后淀粉分子形成新的聚合体成为RS3，但随着温度升高，过高的温度导致直链淀粉过度降解，产生的淀粉聚合度小，也不利于RS3的形成。随着湿热反应时间的延长，在10 h时RS3得率达到最大，之后逐渐减少。湿热处理时间过短，淀粉粒中的直链淀粉分子游离不完全；当处理时间超过10 h后，直链淀粉分子过度降解成一些分子质量小的短直链淀粉分子链，分子链扩散速度快，难以聚集，这都不利于形成RS3[15-16]。

图1 超声波-湿热处理对抗性淀粉含量的影响

2.1.2 正交实验结果

正交实验因素和水平如表1所示，正交实验结果见表2。从表2可以看出，各因素的R值均大于空列R值，表明每个因素对RS3得率的影响都是有效的。这3个因素对RS3得率影响的主次顺序为：B(反应温度)>A(含水率)>C(反应时间)。最优组合为A2B3C1，即含水率为30%，处理温度为130 ℃，处理时间为10 h,RS3的得率最高，为32.173%。

表1 超声波-湿热法制备大米抗性淀粉工艺条件正交实验因素水平

表2 L9(34)正交实验表

2.2 超声波-湿热法结合酸水解制备RS3最佳工艺条件

2.2.1 单因素实验结果

如图2所示，柠檬酸浓度为0.15 mol/L时RS3得率达到最大。酸浓度过低，淀粉分子无法水解为合适的分子链长度，影响直链淀粉分子间的双螺旋结构生成。酸浓度过高，淀粉过度水解，分子链过短，小分子运动强烈，扩散速度快，不易形成有序结晶，RS3得率减少[17-19]。随着加热时间逐渐增加，RS3得率也随之增大，当加热时间达20 min时，RS3得率最大，之后开始下降。加热时间过短，淀粉中直链分子未能完全游离出来，而加热时间过长，直链分子水解过度，产生小分子质量的直链淀粉，不易聚集结晶[17,20]。老化时间在36 h时RS3得率最大。老化时间短，晶核形成和晶体生长不完全，老化时间过长，淀粉糊黏度增大，晶体生长受抑制，直链淀粉难以重结晶，导致RS3得率下降。

图2 超声波酸热处理对抗性淀粉含量的影响

2.2.2 正交实验结果

正交实验因素和水平如表3所示，正交实验结果见表4。3个因素对RS3得率的影响的主次顺序为：A(柠檬酸浓度)>B(加热时间)>C(老化时间)。最佳工艺条件为A3B2C1，即柠檬酸浓度为0.15 mol/L，加热时间为20 min，老化时间为24 h,RS3的得率最高，为40.672%。

表3 超声波酸热法制备大米抗性淀粉工艺条件正交实验因素水平

表4 L9(34)正交实验表

统计分析结果表明，在超声波-湿热法最佳工艺基础之上结合酸水解明显提高了RS3的得率。这是因为酸能进一步水解无定形支链淀粉，破坏支链淀粉的α-1,6键，同时对α-1,4键也有一定的裂解作用，使酸得以进一步渗入和水解并形成短直链淀粉，有利于RS3的生成。

2.3 大米抗性淀粉理化性质

2.3.1 含水量

原大米淀粉、超声波-湿热法制备的RS3、超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3的含水量分别是13.91%、9.24%、6.05%；超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3含水量最低，更容易储存，不容易变质，保质期更长；调浆时，更容易上浆，浆液浓度更准确。

2.3.2 溶解性

原大米淀粉、超声波-湿热法制备的RS3、超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3的溶解性分别是5.16%、1.96%、0.25%。RS3在形成过程中，由于脱支化作用，使得抗性淀粉中直链淀粉含量大于原大米淀粉，且RS3抗性淀粉颗粒内部结构比较致密，水分子不易进入，所以造成溶解性变小。超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3溶解性最低，更易形成抗性淀粉[6,21]。

2.3.3 膨润力

原大米淀粉、超声波-湿热法制备的RS3、超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3膨润力分别是0.667 6、0.611 1、0.580 3 g/g。RS3淀粉颗粒内部由于结构比较致密，水分子不易进入，持水力降低，所以导致膨润力变小。超声波-湿热法结合酸水解制备的抗性大米淀粉的内部结构更为致密，膨润力最小[6,22]。

2.3.4 糊化性质

糊化性质表示了淀粉糊化的难易程度。由表5、图3可知，超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3的峰值黏度、保持黏度、最终黏度、回生值、衰减度与其他两种淀粉相比值最低，呈现极显著性差异，说明有较好的热稳定性。虽然峰值时间降低，但糊化温度较原大米淀粉有所升高。超声波-湿热法制备的RS3峰值时间和糊化温度均较原大米淀粉有升高。

由于在制备RS3的过程中的脱支化作用，分子间键发生断裂而造成结构脆弱，绝大部分转化为取向单一的直链淀粉，且流动性大，所以造成了结果的差异[20-21,23]。

图3 RVA特征曲线

2.3.5 偏光显微观察

淀粉颗粒内部存在着结晶结构和无定型结构这两种结构，在结晶区淀粉分子链有序排列，而在无定型区淀粉分子无序排列，这两种结构在密度和折射率上存在差异，产生各向异性，从而偏振光通过淀粉颗粒时形成偏光十字。如图4～图6所示，原大米淀粉颗粒比较分散，很容易观察到偏光十字，经过超声波-湿热和酸水解处理后，淀粉颗粒都出现聚集现象，虽然处理后淀粉的偏光十字依然存在，但超声波-湿热法结合酸水解较超声波-湿热处理所制备的RS3更为分散，更容易看见偏光十字。

图4 原大米淀粉

表5 三种淀粉间的RVA谱特征值差异

淀粉样品峰值黏度保持黏度衰减度最终黏度回生值峰值时间糊化温度A平均值 3 141 2 275 8663 877 1 602 6.0777.55 B平均值 1 005 8421631289 4477 92.2C平均值 24617472 3151415.53 79.9A变异系数/%15.4310.7712.43 6.69 11.442.9810.96B变异系数/% 7.616.4210.45 4.56 7.21 2.83 9.08C变异系数/% 6.10 4.34 5.14 5.65 9.32 2.24 11.44ta-b 7.27**8.07** 6.69** -15.92**-10.06**1.403.37**ta-c10.17**-5.37** 15.92** -18.68** -18.45**1.13 2.67**tb-c2.77* 2.15* 2.43*-2.49*-2.36* 2.46*1.25

注：*显著性差异，**：极显著性差异；A、B、C分别表示原大米淀粉、超声波-湿热法制得的RS3、超声波-湿热法结合酸水解制得的RS3；ta-b、ta-c、tb-c分别表示a与b、a与c、b与c之间 RVA 特征值的差异。

图5 超声波-湿热法制备的RS3型大米抗性淀粉

图6 超声波-湿热法结合酸水解制备的RS3型大米抗性淀粉

3 结论

超声波-湿热法制备RS3的最佳工艺条件：含水量30%、反应温度130 ℃、反应时间10 h，RS3的得率达到32.173%，其中反应温度是影响得率的最主要因素。在此基础上结合酸水解制备RS3最佳工艺条件：柠檬酸浓度0.15 mol/L、加热时间20 min、老化时间24 h，RS3的得率达到40.672%，其中柠檬酸浓度是影响得率的最主要因素。

研究表明，在超声波-湿热法最佳工艺条件基础上再进行酸水解，其所制备的RS3具有得率高、含水率低、易储存、结构致密、热稳定性好等优点。