Necrostatin-1对脂多糖刺激的断奶仔猪血细胞分类计数和血液生化指标的影响

汪 洋，王秀英，汪龙梅，代 兵，刘秀婷，刘玉兰*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉430023；2.浙江国正检测技术有限公司，浙江杭州310030）

“免疫应激”在养猪生产中普遍存在，免疫应激虽能激活免疫系统以抵抗外来病原对机体的损伤，但免疫系统的过度激活会消耗大量营养物质，导致猪生长受阻，给养猪生产造成一定的经济损失[1]。免疫应激与机体炎症反应密切相关[1]，因此适当抑制炎症反应是缓解免疫应激的重要手段之一。

细胞死亡方式包括自噬、凋亡和坏死。最初人们认为，细胞坏死是极端情况下的纯粹被动和不受控制的细胞死亡类型，但是后来研究发现，一些细胞坏死是可以受到信号调控的。近年来，一种与炎症密切相关的细胞死亡方式——程序性坏死[2]引起广泛关注。程序性坏死可导致细胞肿胀、细胞膜破损和胞内的酶等活性物质外溢，引起周围组织的炎症反应。程序性坏死引起的炎症反应是导致许多疾病发生的重要因素[3-4]。受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）和RIP3是介导程序性坏死的2个关键信号分子。Necrostatin-1（Nec-1）是程序性坏死阻断剂，可以与RIP1信号分子特异性结合，使RIP1不能与RIP3分子发生交互作用，进而导致后续的程序性坏死信号通路不能完成，最终抑制细胞的程序性坏死[2-3]。小鼠模型上的研究已证实，Nec-1在缺血再灌注和炎症等多种因素导致的组织（如脑、脊髓、肠道）损伤或坏死中发挥保护作用[3-5]，但是目前在猪上的研究未见报道。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的毒性成分，能刺激仔猪机体产生急性免疫应激反应，并可引发全身炎症反应综合症[1,6]。最近研究表明，LPS可以诱导程序性坏死[7]。鉴于此，推测Nec-1可能通过抑制程序性坏死，从而抑制或缓解LPS诱导的免疫应激反应。本试验研究Nec-1对断奶仔猪血细胞分类计数和血液生化指标的影响，旨在探究Nec-1是否可以缓解仔猪免疫应激反应进而提高养猪生产水平。

1 材料与方法

1.1 试验材料 二甲基亚砜（DMSO）有效成分＞99.5%，BioFroxx公司提供，注射时溶于PBS中配制成10% DMSO溶液，按0.66 mL/kg体重（BW）腹膜注射。Nec-1有效成分＞98%，MedChem Express公司提供，溶于纯DMSO中配成50 mg/mL，再加入PBS稀释，注射液中DMSO含量均为10%，Nec-1含量分别为5、1.51、0.5 mg/mL，按0.66 mL/kg BW腹膜注射，即3.3、1.0、0.33 mg/kg BW。LPS、大肠杆菌血清型055: B5由Sigma公司提供，注射时溶解于0.9% NaCl溶液。注射液中LPS含量为500 μg/mL，按0.2 mL/kg BW腹膜注射，即100 μg/kg BW。

1.2 试验设计 选择（28±1）日龄、平均体重（9.21±0.66）kg的杜×长×大断奶仔猪25头，分为5个处理组，每个处理组5个重复，每个重复1头猪。5个处理组分别为对照组（10% DMSO+生理盐水）、LPS组（10%DMSO+LPS）、0.33 Nec-1组（0.33 mg/kg BW Nec-1+LPS）、1.0 Nec-1组（1.0 mg/kg BW Nec-1+LPS）和3.3 Nec-1组（3.3 mg/kg BW Nec-1+LPS）。0.33 Nec-1组、1.0 Nec-1组和3.3 Nec-1组注射对应浓度的Nec-1，对照组和LPS组注射10% DMSO溶液。注射Nec-1或10% DMSO 30 min后，对照组注射生理盐水，其他组注射100 μg/kg BW LPS，分别在注射LPS或生理盐水4 h和24 h后采血液样品待测。

1.3 饲养管理 试验在湖北奥登农牧科技有限公司天门市猪场进行。猪舍温度为25～27℃，教槽料饲喂，自由饮水。LPS注射后仔猪因应激导致采食量下降，本试验为了减少各组因采食量的不同而对检测结果产生影响，对照组仔猪的饲喂量根据LPS组仔猪的采食量确定。

1.4 样品采集 在注射LPS或生理盐水4 h和24 h后，从仔猪前腔静脉采血。EDTA管收集3 mL血样用于血细胞分类计数测定。用血浆管采血8 mL，3 000 r/min离心10 min，获得的血浆保存于-80℃超低温冰箱用于生化指标测定。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 血细胞分类计数 血细胞分类计数采用Siemens ADVIA® 2120i全自动血液分析仪测定。

1.5.2 血浆生化指标 血浆生化指标采用HITEC 7100全自动生化分析仪测定，测定方法参照石海峰等[6]方法。1.6 统计分析 数据分析采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析和LSD多重比较。LPS组与对照组相比较，以确定LPS刺激的影响；LPS组与不同浓度的Nec-1组相比较，以确定注射不同剂量的Nec-1对LPS刺激仔猪的影响。统计结果用平均值和SEM表示。以P＜0.05表示差异显著，以P＜0.10表示具有显著性趋势。

2 结 果

2.1 Nec-1对LPS刺激仔猪血细胞分类计数的影响 由表1可知，注射LPS 4 h后，与对照组相比，LPS组白细胞、嗜中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、嗜酸性粒细胞绝对值、嗜碱性粒细胞绝对值、单核细胞比例、血小板和血小板容积比显著降低（P＜0.05），红细胞、血红蛋白、红细胞压积和血小板分布宽度显著升高（P＜0.05）。与LPS组相比，1.0 Nec-1组可以显著提高红细胞平均血红蛋白浓度（P＜0.05），0.33 Nec-1、1.0 Nec-1和 3.3 Nec-1组均可显著缓解LPS刺激导致的血小板分布宽度升高（P＜0.05）。

注射LPS 24 h 后，与对照组相比，LPS组单核细胞绝对值、淋巴细胞比例、单核细胞比例、嗜碱性粒细胞比例、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板和血小板容积比显著降低（P＜0.05），白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞绝对值、嗜中性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞比例、血小板平均体积和血小板分布宽度显著升高（P＜0.05）。与LPS组相比，3种浓度Nec-1处理均可减轻LPS刺激导致的嗜酸性粒细胞比例升高（P＜0.05），0.33 Nec-1和3.3 Nec-1组降低了嗜酸性粒细胞绝对值（P＜0.05），1.0 Nec-1组有降低嗜酸性粒细胞绝对值的趋势（P=0.061）。

2.2 Nec-1对LPS刺激仔猪血浆生化指标的影响 由表2可知，注射LPS 4 h 后，与对照组相比，LPS组血浆谷草转氨酶（AST）活性和AST/谷丙转氨酶（ALT）显著升高（P＜0.05），葡萄糖、总蛋白、白蛋白含量和肌酸激酶活性显著降低（P＜0.05）。与LPS组相比，0.33 Nec-1组缓解了LPS刺激导致的AST活性和AST/ALT的升高（P＜0.05），1.0 Nec-1组缓解了葡萄糖含量和肌酸激酶活性的降低（P＜0.05）。

表1 Nec-1对LPS刺激的仔猪血细胞分类计数的影响

续表1

注射LPS 24 h后，与对照组相比，LPS组血浆AST活性、AST/ALT和尿素含量显著升高（P＜0.05），葡萄糖、白蛋白、总胆固醇含量和肌酸激酶活性显著降低（P＜0.05）。与LPS组相比，0.33 Nec-1组缓解了肌酸激酶活性的降低并提高了总胆固醇和甘油三酯含量（P＜0.05），1.0 Nec-1组有缓解LPS刺激导致的AST/ALT升高的趋势（P＜0.10），3.3 Nec-1组可以缓解AST/ALT升高和葡萄糖含量的降低（P＜0.05），并有缓解总胆固醇含量降低和AST活性升高的趋势（P＞0.05）。

3 讨 论

LPS作为一种热稳定的毒素，可以诱导仔猪在短时间内产生细菌感染症状，并且可以诱导程序性坏死[1,7-8]。在结肠炎相关的肿瘤小鼠模型中，Nec-1可以显著缓解炎性细胞因子的过量产生，减轻结肠炎症，抑制肿瘤的生长和发展[4]。因此，推测Nec-1对LPS刺激导致的断奶仔猪免疫应激有缓解作用。

血细胞分类计数一般包括白细胞、红细胞和血小板的计数。白细胞包含嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。白细胞总数及其分类计数的变化可以反映机体的炎症状态[9]。嗜酸性粒细胞可以产生具有较强细胞毒性的超氧化物及溶酶体酶等。有研究发现，过敏、传染病等因素均可导致机体嗜酸性粒细胞比例升高，且嗜酸性粒细胞的数量和与之相关的疾病严重程度呈正相关[10]。红细胞主要为机体运输氧，其中，血红蛋白是红细胞的组成部分[6]。血小板参与凝血，也可以释放氧自由基达到抗菌的作用，还可产生趋化因子，促进单核细胞和淋巴细胞的定向运动[11]，其中，血小板分布宽度与代谢综合征相关[12]。本试验结果显示，注射LPS后，血细胞分类计数发生了显著的变化，这些结果与石海峰等[6]结果相似，说明LPS刺激会导致仔猪产生急性免疫应激反应。注射LPS 24 h后，3种浓度Nec-1缓解了LPS刺激导致的嗜酸性粒细胞比例的升高，0.33 mg/kg BW Nec-1和3.3 mg/kg BW Nec-1降低了嗜酸性粒细胞绝对值，1.0 mg/kg BW Nec-1有降低嗜酸性粒细胞绝对值的趋势。有研究表明，嗜酸性粒细胞可以分泌嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，这种蛋白参与宿主的免疫防御，可以与LPS特异性结合起到抗菌作用[13]。LPS引起的嗜酸性粒细胞升高的具体原因目前尚未见报道，这可能与机体的自身调节有关，但需要进一步研究。Nec-1可能通过阻滞程序性坏死信号通路以减轻炎症，从而缓解了LPS导致的负面影响。

血液生化指标可在一定程度上显示机体整体代谢的情况，也可用于推断某些组织或器官的健康状态。血液中ALT和AST活性可反映肝功能状态，这2种酶活性的升高常见于组织损伤中[14]。本试验中，0.33 mg/kg BW Nec-1和3.3 mg/kg BW Nec-1分别缓解了LPS刺激4 h和24 h后AST和AST/ALT的升高，表明Nec-1具有保护肝脏的作用。与此类似，在创伤性诱发出血性休克大鼠上的研究也发现Nec-1可以降低AST和ALT活性[15]。Kim等[7]发现，Nec-1可降低ALT活性，抑制Toll样受体4信号通路，缓解D-氨基半乳糖/LPS诱导的程序性坏死和急性肝损伤。

表2 Nec-1对LPS刺激仔猪血浆生化指标的影响

此外，其他血液生化指标也具有重要意义，可反映机体的生理状况。血糖水平直接反映了机体对日粮中碳水化合物的吸收效率[14]；甘油三酯水平的高低可反映机体对脂类的吸收状况[16]；胆固醇是维生素D合成的前体物质，也是血液中脂类转运的关键因子[16]；肌酸激酶可以促进机体磷酸肌酸与ADP反应生成ATP和肌酸来保证组织细胞能量供应，是机体能量代谢的重要酶类[17]。本研究表明，LPS刺激降低了葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇和肌酸激酶水平，说明LPS刺激会影响机体营养物质利用，阻碍能量代谢，这与本课题的前期研究结果相似[6,18-19]。本试验中，Nec-1提高了葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯水平并缓解了肌酸激酶活性降低，说明Nec-1能在一定程度上缓解LPS刺激导致的血液生化指标的变化。

不同Nec-1剂量对机体的影响具有较大的区别，这可能是因为3个剂量的Nec-1（3.3、1.0、0.33 mg/kg BW）浓度差距大。此外，与小鼠上Nec-1的效果相比[3-4]，本试验中Nec-1对LPS诱导的仔猪应激反应，尤其是对血细胞分类计数的变化仅体现出轻微的缓解作用，其原因可能包括2个方面：①Nec-1注射液是悬浊液，其中高浓度的3.3 mg/kg BW Nec-1溶解度并不理想，这可能影响了机体对Nec-1的吸收；②本试验选择的Nec-1注射剂量及Nec-1与LPS注射时间间隔（30 min）是参考了小鼠实验[3-4]，再根据黄继汉等[20]提供的小鼠和猪之间的等效剂量换算公式得出，因此，Nec-1剂量可能不是作用仔猪的最适宜剂量，其时间间隔是否合理也需进一步验证。

4 结 论

LPS刺激会引起断奶仔猪血细胞分类计数和血液生化指标的变化，而Nec-1可一定程度缓解LPS刺激导致的负面影响，这说明LPS诱导的免疫应激反应可能与程序性坏死相关，Nec-1可能通过抑制程序性坏死来缓解猪的免疫应激，进而提高养猪生产水平，但具体的作用机理还需进一步探索。