连续流动注射法测定水产品中的亚硝酸盐含量

朱敬萍，于丁一，胡红美，梅光明，金 雷，顾蓓乔

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

亚硝酸盐氮是海水中浮游生物和藻类生长、繁殖必不可少的营养元素之一，尤其是在沿海地区，大量未经处理过的工业废水以及生活污水，直接通过河流排入湖泊、海洋，这些物质富含氮、磷等营养物质，容易造成水体的富营养化[1-2]。随着水体中氮、磷的富集，藻类及其它浮游生物会快速繁殖，引发赤潮对海洋生态安全造成威胁，同时受污染的水体会使鱼类或其它生物大量死亡。在海水养殖中，当亚硝酸盐含量小于0.1 mg/L时，一般不会对鱼类产生明显损害[3-4]；当亚硝酸盐含量为0.1～0.5 mg/L，会呈现明显中毒症状；而当亚硝酸盐的含量大于0.5 mg/L时，中毒症状则会明显加剧，鱼类的某些器官会出现衰竭现象，严重时甚至导致死亡[5-7]。人体如果长期摄入过量的亚硝酸盐可引起急性中毒[8-9]，血红蛋白变性和癌变[10]等症状，联合国粮农组织和世界卫生组织规定人体每天最多摄入亚硝酸钾或亚硝酸盐的量为0.2 mg/kg。

目前亚硝酸盐检测方法众多，主要采用离子色谱法、极谱法、催化动力学法、荧光法、可见分光光度法、流动注射法等[11-16]，近年来，水体中亚硝酸盐的连续流动注射分析法发展迅速[17-18]，但采用该法进行水产品中亚硝酸盐含量测定报道很少。该方法使用的仪器设备简单，试剂消耗少，操作简单，自动化程度高，频率高（50个/h），对实际样品分析效果好。食品分析以GB 5009.33-2010分光光度法为主，本文采用紫外可见分光光度法与流动注射法进行水产品中亚硝酸盐含量测定，并进行方法比较，对浙江海域、养殖区及养殖场采集的样品进行初级水产品质量安全监测检测分析，以期了解和掌握浙江海域和养殖区初级水产品质量安全的状况。

1 材料与方法

1.1 方法原理

在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺反应，生成偶氮化合物，再与萘乙二胺盐酸（NEDD）反应生成紫红色化合物，并在550 nm波长下检测。

1.2 主要仪器与试剂

德国SEAL Analytical AA3流动注射分析仪；LED光度计。TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；超声波（宁波海曙科生超声设备有限公司）；实验室其它常用仪器及器皿。

100 mg/L-N亚硝酸盐标准储备液：购自中国计量科学研究院，国家标准物质。使用时，配制成5.0 mg/L-N亚硝酸盐标准使用液。

显色剂：配制时，700 mL去离子水中加入100 mL磷酸，加入10.0 g磺胺，待完全溶解后，再加入0.50 g盐酸萘乙二胺（NEDD）和4 mL Brij-35，30%溶液（活性剂），最后用去离子水稀释至1000 mL，混匀。试剂无色，储存于棕色瓶中，冷藏。测定前所有试剂均需超声脱气。

饱和硼砂溶液（50 g/L）：称取5.0 g硼酸钠，溶于100 mL热水中，冷却后备用。

亚铁氰化钾溶液（106 g/L）：称取106.0 g亚铁氰化钾，用去离子水溶解，并稀释至1 000 mL。

乙酸锌溶液（220 g/L）：称取220.0 g乙酸锌，加入30 mL冰醋酸溶解，用去离子水稀释至1 000 mL。

所有试剂均为分析纯。实验用水为去离子水（18.2 MΩ·cm）。

1.3 仪器测定条件

启动AA3流动注射分析仪软件，设定实验参数：选择通道、杯续杯数、样品数；进样/冲洗：1.5；平滑：16；基线校正：自动基线参比10%，运行延迟时间6.0 min。设置进样速率为60个/h。泵入去离子水至基线稳定后，插上加热池（37℃）电源，再泵入试剂到进样通道，达到试剂基线稳定；测定样品前，先测标准曲线中标准溶液浓度的最高点，在最佳峰高75%～95%之间，设定它的增益点。然后开始自动分析。启动工作程序,仪器自动取样并进行分析检测，分析全部完成后电脑自动输出各样品和标准系列的浓度值。亚硝酸盐流动注射分析模块如图1。

1.4 样品采集与预处理

图1 亚硝酸盐流动注射分析模块流路图Fig.1 Flow injection analysis module flow chart of nitrite

于2015年8月至12月分别在浙江海域和乐清湾养殖区及养殖场，共采集了25个品种共计170个样品，进行初级水产品质量安全监测。其中，海水鱼：鲈鱼、黒鲷、小黄鱼、带鱼、马鲛鱼、龙头鱼、鲳鱼和鰳鱼；淡水鱼：鲫鱼、白鲢、白鲳、鳊鱼、鲤鱼和鳙鱼；虾蟹类：南美白对虾、白虾、红虾、梭子蟹、青蟹和中华沙蟹；贝类：泥蚶、毛蚶、缢蛏、青蛤和文蛤。采集的鲜活样品冰冻保鲜运回实验室，然后对不同种类的样品进行下一步的处理。取样品肌肉可食部分，用高速粉碎机匀浆，放入-20℃冷库保存备用。

样品的预处理：准确称取5.00 g左右试样，置于50 mL烧杯中，加入12.5 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，使用300 mL 70℃的热水将试样洗入500 mL容量瓶中，然后在沸水浴中加热15 min，并不时振摇，取出在冷水浴中冷却至室温。

提取液净化：将上述提取液，边振荡边加入5.0 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5.0 mL乙酸锌溶液，使蛋白质沉淀。加水至刻度，摇匀，静置30 min后，除去上层脂肪，取上清液，过滤，并将初滤液30 mL弃去，然后将滤液备用。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

在反应条件下，样品和试剂的流速会产生变化，同时通过流速中的反应温度也会有变化。本实验首先研究了试剂及载流流速对信号的影响。结果表明，在流速0.20～2.00 mL/min范围内，随着速度加快，峰高先逐渐增大，达到一定程度后峰高重现性变差，经过反复测试，当试剂流速为0.80 mL/min，载流流速为1.20 mL/min时，信号响应最高，呈稳定状态，因而设置为最佳流速。当选择进样体积在0.2～1.2 mL时，发现进样体积太小或太大，都会引起反应不完全或带过，影响实验结果；经过反复测试表明，信号响应值随进样体积增大而缓慢增加；为保证检测频率，本研究最终选择进样体积为0.5 mL，反应温度为37℃为最佳。

2.2 显色剂优化

显色剂中磺胺用量对光电压产生较大的影响，在1 L显色剂中分别加入磺胺的量为：2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、12.0 g、14.0 g，结果表明，随着磺胺用量的增加，吸光度值先增大后减小，当加入磺胺10.0 g时，吸光度值达到最大。因此，最终选用磺胺质量为10.0 g。

2.3 标准曲线、方法检出限

用5.0 mg/L-N亚硝酸盐标准使用液，设定检测范围0.00～0.250 mg/L和检测范围0.0～0.150 mg/L，分别绘制分光光度法和流动注射法标准曲线。结果表明：两种方法在质量浓度范围内均具有呈良好的线性关系。

空白鲈鱼样品通过添加标准溶液后经前处理，分别用AA3流动注射分析仪和分光光度法检测分析，方法检出限（LOD）为信噪比S/N=3的样品浓度，计算得出AA3流动注射分析仪和分光光度法检测亚硝酸盐的LOD分别为0.81和1.00 mg/kg，方法回收率均大于80%，由此可见本研究建立的连续流动注射法与国标分光光度法，结果保持一致，能满足实际样品分析要求。方法线性回归方程、相关系数、检出限见表1。

表1 连续流动注射法和分光光度法的线性回归方程，检出限Tab.1 Linear regression equation,limits of detection(S/N=3)of continuous flow injection analysis and spectrophotometry

2.4 准确度和精密度

通过优化好的测量条件，经AA3流动注射分析仪，在空白小黄鱼、青蛤和南美白对虾样品中，分别加入低、中、高3个浓度水平的标准溶液进行加标回收试验，计算回收率和RSD，考察方法准确度和精密度。（表2）表明，3个不同加标水平下，亚硝酸盐平均回收率为81.8%～97.6%，批内相对标准偏差4.98%～10.8%之间，结果表明该方法回收率较高、精密度较好，能满足不同水产品中亚硝酸盐检测要求。测定结果见表2。

表2 不同加标水平下的回收率和精密度（n=6）Ta.2 Results of recovery and precision of different spiked samples(n=6)

2.5 实际样品及加标回收率实验

本文对浙江海域和乐清养殖区及养殖场采集的样品，对不同种类的样品进行前处理，取其肌肉可食部分5 g左右进行提取，将提取液净化后进行分析，用流动注射法平行测定3次，结果均为未检出，并采用国标法分光光度法进行验证，结果保持一致，也均为未检出。同时对建立的流动注射法采用标准加入法对实际样品进行加标回收试验（n=6）分析结果见表3。

表3 实际样品测定结果（n=6）Tab.3 Analytical results of the samples(n=6)

由表3可知，AA3流动注射分析仪测定样品的加标回收率为81.0%～105.8%，相对标准偏差RSD为0.48%～6.56%，准确度较好。结果表明，该方法有较好的精密度，线性范围较宽，回收率、检出限满足分析方法要求。

3 小结

本研究建立了水产品中亚硝酸盐连续流动注射分析法，优化了样品前处理和分析测试条件，最佳条件下。标准曲线在0.0～0.250 mg/L浓度范围内呈线性关系，相关系数为0.999 9，检出限为0.81 mg/kg，该方法简单、快速，自动化程度高，基体干扰较小，线性范围较宽，回收率、检出限满足分析方法要求，适用于不同水产品中亚硝酸盐的监控。本研究为科学制定水产品中亚硝酸盐测定提供了有力的技术支撑。