维C不同补充时间对运动小鼠血细胞DNA氧化损伤的影响

苏美华，许庆忠，张水莲

(闽南师范大学体育学院,福建漳州 363000)

运动性氧应激引起脂质过氧化反应是造成细胞DNA损伤的机制之一[1-3]。补充抗氧化剂来预防或缓解DNA损伤已经得到实验证实[2-3]。维生素C(VC)具有良好的抗氧化作用，可以清除体内过量的自由基，预防氧应激对机体的DNA损伤，保护细胞的正常功能[4-6]。但目前有关大强度运动下VC补充时间及效应还尚缺乏研究报道。本文采用彗星实验[3]对力竭运动导致的外周血细胞DNA损伤情况进行检测，通过运动前两小时和运动后两小时补充维生素C观察其对血细胞DNA损伤和自由基的影响，为健身人群在剧烈运动环境下如何选择补充维生素C的时间提供数据参考，从而采用更为有效的方法和手段来预防和消除运动疲劳所产生的副作用。

1 实验材料与方法

1.1 动物分组与VC的补充

实验动物采用7～8周昆明纯系健康清洁级雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司购买)，体重29.42±1.89g，置于清洁消毒动物房，室内温度20±3℃，相对湿度50±5.5%，分笼饲养，自由饮食，自然光照昼夜比12h∶12h。小鼠随机分为对照组(CG)、运动组(EG)和运动前两小时补充VC组(VCG+E)以及运动后两小时补充VC组(E+VCG),共4组，每组各8只，共32只。对照组采用正常饲养，VCG+E和E+VCG分别在每天运动前和运动后2小时补充VC(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)，剂量为每天150mg/kg体重，剂量浓度10mg/mL[6],连续补充6天。对照组每天灌胃0.40mL生理盐水。

1.2 力竭运动动物模型的建立

力竭运动模型根据Marra[7]报道建立。各组小鼠休息3天后，第4天各运动组采用跑台适应性练习3天，适应跑速从10m/min至28m/min。再休息2天，第8天开始正式训练，坡度0°，速度10m/min，10min内逐渐调节跑速至28m/min，以此跑速持续运动至力竭。各组每天上午10∶00训练，持续6天。力竭标准：随着运动时间的延长，动物不再坚持原跑速，跟不上跑台速度，滞于跑道后1/3处达3次以上，采用任何刺激驱赶无效，跑完后体征为腹卧位，神情倦怠，呼吸急促，对刺激反应迟钝[1-2]。

1.3 采血与单细胞悬液制备

各运动组分别在最后一天训练至力竭即刻眼眶取血2滴(约2mL)置于加有200μl枸橼酸钠抗凝剂的离心管内，置于4℃冰箱待测。显微镜下用预冷的PBS将各血样的100μl血液调整成含2×104个/mL的细胞悬液。

1.4 彗星实验流程

实验方法根据Mastaloudis[3]报道稍加改进。每只血样制作2张载玻片，制好的载玻片置于水平电泳槽中，将新配置的碱性电泳缓冲液倒入电泳槽，约覆过胶面0.25cm左右，放置20min，使DNA双螺旋解旋。解旋后，电泳槽设置为25V、250mA的条件，电泳30min。停止电泳后，小心将玻片取出放入中和缓冲液中和15min。取出玻片，滴加浓度5μg/mL的EB染液30～50μL到胶体表面，盖上盖玻片，染色15～20min后，在荧光显微镜下观察拍照。

1.5 抗氧化酶SOD、GSH活性与MDA水平的测定

各组血样离心后，取血浆测试。采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力；采用比色定量法检测细胞还原型谷胱甘肽(GSH)的浓度；采用硫代巴比妥酸比色法(TBA法)来测定过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，并按说明书操作。

1.6 统计分析

荧光显微镜调至515～560nm的激发光模块，在200×下，随机观察每张载玻片上的5个视野，每个视野5个细胞以上。采用IMI1.0彗星分析软件(深圳良正软件开发有限公司)测定尾惯量、Olive尾矩、分布矩等指标[3]，运用统计软件EXCEL2010和SPSS17.0对数据进行单因素方差分析，均值间的多重比较采用Duncan’s法检测，数据以均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 各组小鼠血细胞DNA损伤的彗星图

荧光显微镜下观察染色片发现，CG的绝大部分血细胞无显著拖尾现象，边缘光滑，荧光强度均匀，即圆圆的彗星头部(图1-A)；EG的多数血细胞彗星头部直径减小，“彗星”尾部逐渐变长变大，尾部的荧光强度增强，拖尾的彗星样细胞明显增多(图1-B)；而VCG+E血细胞仍接近圆形荧光图，但部分细胞彗星头部略有缩小(图1-C)，E+VCG小鼠也有部分细胞出现“彗星尾”，但拖尾现象看起来不是很明显(图1-D)。

2.2 各组小鼠血细胞DNA损伤的彗星软件分析

采用彗星软件分析各组小鼠血细胞的DNA损伤形态图。通过分析发现(表1)，EG小鼠血细胞尾惯量、Olive尾矩和彗星分布矩显著高于CG(P<0.001)，VCG+E和E+VCG组这三个指标则显著低于EG，而VCG+E低于E+VCG(P<0.05)。

表1 各组小鼠血细胞DNA彗星指标

注：与CG比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与EG比，#P<0.05,###P<0.001。

2.3 小鼠血浆中SOD活性、GSH和MDA含量的检测

各组血浆SOD活性、GSH浓度和MDA的含量检测结果见表2。从表2可知，EG血浆SOD活性、GSH和MDA含量显著高于CG(P<0.001)，VCG+E和E+VCG小鼠血浆中SOD活性和MDA含量都显著低于EG，且VCG+E低于E+VCG(P<0.05)。

表2 力竭运动后小鼠血浆中SOD活性、GSH和MDA含量

注：与CG比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001；与EG比，#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001。

3 讨论

DNA极易遭到外源性毒性物质以及内源性代谢氧化产物等因素的损害，从而产生DNA链断裂、糖基或碱基损伤以致细胞突变或死亡，进而诱发癌变[8]。大强度运动时所产生自由基是机体安静时的20倍以上，可对机体的心肌、血细胞、淋巴等细胞DNA产生显著的损伤效应[1-3]，本实验也发现6天的大强度运动可对小鼠血细胞DNA产生严重的损伤作用并导致小鼠血浆SOD活性、GSH和MDA含量显著升高，表明大强度运动所致的血细胞DNA损伤与氧化应激有密切关系。

维生素C被认为是抗氧化营养素，能够直接与脂氧自由基或脂过氧自由基反应，使脂质过氧化链式反应中断而起到抗氧化的作用[4-5]。有研究证实氧化应激增强可诱导抗氧化酶活性升高，当细胞受到一个可容忍浓度的氧自由基作用后，细胞就能通过激活抗氧化酶活性产生抗高浓度自由基的能力[6-7]。本实验发现，补充VC小鼠在大强度运动后，血浆SOD活性、MDA含量均显著低于EG，说明补充VC使机体受到的氧化应激水平显著低于不补充组，提示维生素C具有抗氧化能力，能参与清除机体所产生的自由基，有效地抑制了大强度运动所产生的氧化应激；另一方面VC还能促进和调动抗氧化酶系，激活抗氧化能力，阻断某些诱变因素，抵抗外界因素如大强度运动所诱发的大量自由基攻击，从而保护DNA免受过氧化脂质损伤[8-9]。大强度运动所导致的血细胞DNA损伤与运动性氧应激有关，而维生素C还是一种水溶性抗氧化剂和自由基修复剂[9-10]，可同体内重要的酶类抗氧化剂如超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱苷肽酶(GSH)等构成体内抗氧化损伤的第一道重要防线，保护机体细胞免受自由基的氧化损伤，从而抑制和减少DNA链的断裂，使细胞DNA损伤水平降低[10]。本实验发现，运动前两小时补充VC的DNA损伤值显著低于运动后两小时补充VC，提示运动前补充VC增加了机体抗氧化能力储备，减缓了运动后自由基对细胞DNA的损伤作用，从而提高了VC的保护效应。

4 结论

大强度运动可通过氧化应激介导小鼠血细胞的DNA损伤，运动前2小时补充VC较运动后补充VC更能有效抑制运动性氧应激，发挥抗氧化效应，缓解大强度运动所致的细胞DNA损伤。