临沂地区高毒力肺炎克雷伯菌的分子特征分析

(山东医专附属医院，山东 临沂 276000)

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae，KP)是临床上常见的致病菌，可引起各种感染，根据荚膜多糖抗原可分为79个血清型，根据致病性的不同可分为普通KP(cKP)和高毒力KP(hvKP)。与cKP相比，hvKP除了具有高黏液表型，还携带多种毒力基因，具有更高的毒力，可导致多部位感染，如脑膜炎、眼内炎及坏死性筋膜炎等，严重者可危及生命[1]。hvKP的荚膜型主要为K1、K2、K5、K16、K20、K54和K57型[2]。在由KP引起的感染中，hvKP所占的比例逐年升高，对抗生素的敏感性逐年降低，产ESBLs和KPC酶的hvKP陆续出现，hvKP在临床感染中受到越来越多的重视。本研究将分析临沂地区hvKP的黏液表型、荚膜分型、毒力基因携带情况，从而为hvKP的实验室诊断和临床防治提供有效的参考信息。

1 对象和方法

1.1研究对象 2015年1月至2016年5月就诊于临沂市人民医院69例患者标本中培养分离的KP，患者临床表现为具有某一器官或多器官感染。

1.2研究方法 对自患者标本中分离出的69株KP进行黏液丝试验(String test，ST)、荚膜分型、毒力基因检测，寻找致病菌的分子生物学特征。

1.2.1ST试验 将KP接种于含5%羊血的琼脂平板上，37 ℃培养16～18 h后，用接种环轻轻向上挑起菌落，如不能挑起黏液丝或黏液丝长度小于5 mm，则ST试验阴性，若黏液丝长度大于或等于5 mm，则ST试验阳性[3]。ST阳性菌落为高黏液型，菌株属于高毒力株，即hvKP。

1.2.2荚膜分型及毒力基因的检测 采用PCR扩增法检测，步骤如下：(1)DNA模板提取：挑取35 ℃培养16～18 h的KP菌落于400 μL去离子水的EP管中，置入100 ℃加热仪中加热15 min，12 000 g离心5 min，吸取上清液，提取DNA。(2)PCR反应：K1、K2、K5、K54、K57、rmpA和aerobactin的引物序列和反应条件见参考文献[4]。引物由上海生工合成，Primix购自Takara公司，含扩增所需缓冲液、dNTP、Taq酶及Mg2+。反应体系为25 μL，Primix10 μL、模板3μL，10 μM的上下游引物各2 μL，水8 μL。(3)电泳及成像：使用100 V电压、1%琼脂糖凝胶对产物进行电泳，凝胶成像仪对电泳后的产物进行成像。

2 结果

69株KP中具有高黏液表型的hvKP有37株，cKP32株。37株hvKP的荚膜分型及毒力基因携带情况见表1，PCR结果见图1。32株cKP中，K1型占3.1%，K2型占12.5%；rmpA的携带率为9.4%，aerobactin的携带率为15.6%。

图1 荚膜分型及毒力基因的电泳图

表1 37株hvKP的分子生物学特性

3 讨论

一直以来，hvKP的高侵袭力、高致病性是备受关注的问题。hvKP易侵入血流后引起其它部位的脓肿，如脓毒血症、肺脓肿、全身中毒性休克综合征、脑脓肿、眼内炎及神经炎等，最常见的是肝脓肿，部分感染者短时间内不易治愈，有时反复发作，对病人的健康和生命安全造成很大的威胁。诊断hvKP的依据中，除了其生物学特性，临床症状也是非常重要的鉴定指征，从致病性方面来看，肝脓肿是hvKP感染最常见的症状[5-7]。目前，鉴定hvKP的指标还未形成统一标准，实验室诊断的特征是高粘液表型，但研究发现并不是所有的hvKP都是高粘液表型[8-10]。为此，对该病的防治需要进一步寻求鉴定指征。

血清型K1和K2的荚膜一直以来被认为是重要毒力因子。K1血清型在hvKP菌株的表达率约为47%～81%、K2约为20%[11-12]。因为hvKP菌株引起的肝脓肿以K1或K2型居多，最初这些荚膜血清型被认为是这种感染性综合征的重要的毒力因子。本研究发现K1和K2是hvKP菌株常见的荚膜血清型，因此K1或K2型可以作为实验室的辅助指标诊断hvKP。

高毒力株的高黏液表型与黏液表型调节基因rmpA相关，该基因可正向调控荚膜多糖的合成，使其产量增加，菌落表现为黏液型。Aerobactin是一种铁载体，可与宿主的转铁蛋白竞争铁离子，动物模型显示，aerobactin可使KP的毒力增强100倍，也与菌落的黏液性相关。这两种基因常存在于hvKP中，许多研究表明hvKP菌株毒力水平高是由于荚膜表达增加(高粘液表型)和同时伴随铁的获取能力增加及其它尚未明确的因素。本研究数据表明携带高毒力因素KP的rmpA、aerobactin基因的表达较高，这与文献研究一致。本研究中收集的hvKP全部表达aerobactin基因或rmpA，因此rmpA或aerobactin基因可以作为实验室诊断hvKP的辅助参考指标。