白僵菌对栗实象甲幼虫血细胞数量的影响

赵俊芳，樊金华，冀卫荣

（山西农业大学林学院，山西 太谷 030801）

栗实象甲（Curculio davidi Fairmaire）又名栗实象鼻虫、栗蛆，属鞘翅目象甲科，为世界性板栗害虫，该害虫分布广泛，是各个板栗产地的主要害虫之一[1]。2015年我国板栗总面积达到180万hm2，年产量195万t，占世界板栗总产量的84%[2]。栗实象甲幼虫危害果实，成虫以取食栗树的幼叶和嫩芽为主，晚上蛰伏在叶子重叠处。该害虫繁殖能力极强，当晚进行交配第2天便可产卵，并且该成虫反应灵敏，遇到危险时能迅速飞逃，导致防治效果一直不太显著[3]。随着社会进步和科学技术的发展，人们对该害虫的防治方法越来越多，但近年来板栗害虫防治效果仍不太明显，每年仍有20%～45%的板栗果实受损害，严重地区可达70%以上，造成巨大的经济损失[4-6]。

虫生真菌在我国害虫防治方面应用很广泛。在我国北方，人们利用白僵菌成功防治了一种极难控制的森林害虫——马尾松毛虫，在我国南方，使用白僵菌对水稻害虫有着极好的防治效果。南非等国使用金龟子绿僵菌防治飞蝗害虫，而巴西等国利用金龟子绿僵菌防治甘蔗沫蝉等害虫。近些年，由于生物技术变得更加成熟，越来越多的虫生真菌产品进入市场，产生了巨大的经济效益，市场前景广阔[7-8]。

本研究采用球孢白僵菌对栗实象甲幼虫进行侵染，通过观察虫体的病变特征及血细胞数量的变化，了解球孢白僵菌对栗实象甲幼虫的致病性及致病力，为球孢白僵菌投入实践防治栗实象甲提供有力依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 本试验使用从中国科学院购买的SYN01球孢白僵菌作为供试菌[9]。

1.1.2 供试虫源 2016年10月下旬由山西省晋中市昔阳县农家购买板栗，带回学校，在地上平铺塑料膜并盖上一层新鲜湿润的土壤，这时把板栗均匀平铺在土壤上，等待幼虫出土，每天保持土壤湿润给幼虫出土提供合适的条件。3 d左右就有幼虫出土，每天从土里捉虫并把幼虫保存到合适的生存环境中，这种出土状态大约保持14 d。取出来的栗实象甲幼虫即为试验对象。

1.2 试验方法

1.2.1 供试菌株及孢子悬浮液的制备 供试菌株球孢白僵菌SYN01，用PDA培养基（马铃薯2 g、葡萄糖 0.2 g、琼脂 0.15～0.2 g、蒸馏水 10 mL，自然pH）培养，直到白僵菌完全产孢，在无菌环境下的操作台里，用接菌环将5板球孢白僵菌SYN01刮入50 mL的三角瓶内，分别加入等量的20 mL含0.05%吐温－80的蒸馏水，摇匀，制得浓度为3.2×108孢子/mL的白僵菌孢子悬液，然后取出少量，稀释后得到1.6×107，8×106孢子/mL这2个浓度。

1.2.2 同种白僵菌的3个浓度对栗实象甲幼虫的高致病力筛选 选择状态相同的栗实象甲幼虫200只，将其随机分为4组，3个试验组1个对照组（以吐温-80溶液为对照），用灭菌后的移液枪吸取10 μL准备好的球孢白僵菌孢子悬浮液，均匀滴涂于一只虫体的体表。将感染不同浓度球孢白僵菌孢子悬浮液的虫子分别放入灭过菌的有土烧杯中。将放有处理过虫子的烧杯均置于恒温培养箱（RH＞95%）中，等待血细胞的采集。

1.2.3 血淋巴的采集 用灭过菌的镊子从烧杯中取4只虫子，用75%的酒精对虫体进行表面消毒，然后用无菌水冲洗干净，用吸水纸吸干虫体表面水分。

将虫体固定，在靠近虫体头部的背面，用昆虫针沿背面表皮穿刺，血淋巴会从伤口溢出，呈小水珠状，用2.5 μL的移液枪吸取血淋巴。

1.2.4 血细胞的观察和鉴定 将收集的淋巴液集于EP管中，管中有提前放入的预冷抗凝血剂以防止黑化。用移液枪在EP管中抽推几次，以达到混匀的效果，然后用2.5μL的移液枪在EP管中吸取2μL的收集液，滴于用酒精擦拭过的血球计数板上，置于显微镜下观察血细胞的个数，并记录。

2 结果与分析

2.1 侵染后虫体及血细胞的变化

栗实象甲幼虫被真菌侵染后，48 h后虫体由原来的浅黄色变为白色，体壁与对照相比质软，穿刺更容易；72 h时部分虫体出现针孔大小的黑死斑点，一只有5～8个斑点，此时活性明显降低，同时取出的血淋巴呈浑浊且无形状，内脏更易从伤口随淋巴液流出，但对照为偏黄色透明水珠。

2.2 白僵菌对虫体血细胞数量的影响

为了了解菌液对血细胞数量的影响，以侵染栗实象甲幼虫的时间点为零点，以此类推，分别在侵染后的3，6，12，24，48，72，96 h 对血细胞数量进行统计。结果发现，在浓度为3.2×108孢子/mL的球孢白僵菌孢子悬液侵染下，栗实象甲幼虫在3～6 h血细胞数量呈上升状态，6～72 h时血细胞数量急剧下降并在72 h达到最低值。在1.6×107孢子/mL的白僵菌孢子悬液侵染下，3～6 h血细胞数量缓慢上升，在6～12 h血细胞数量恢复到与3 h时基本相同，12～48 h血细胞数量以上升状态增长，48～96 h血细胞数量呈下降状态并且在72 h数量也达到一个最低值。在8×106孢子/mL的白僵菌孢子悬液侵染下，栗实象甲幼虫血细胞数量在3～96 h过程中血细胞数量一直是下降状态，并在72 h达到最低值，之后变化较为平缓。CK组的栗实象甲幼虫血细胞数量在3～12 h时呈上升状态，12～96 h时呈急剧下降状态，48 h后较为平稳（图1）。总体上与对照组相比，试验组的栗实象甲幼虫血细胞的数量呈现出先升高后降低的动态变化。

3 结论与讨论

栗实象甲是采用两性生殖（Sexual reproduction）繁殖后代的，6—7月份成虫羽化，在土中潜伏10～15 d，等到栗蓬长到核桃大小时钻出土面，出土时期多集中于每年的7—8月[10]，白天在栗树上取食栗树的幼叶和嫩芽，取食一段时间，等到营养充足之时开始交配产卵且周期极短，次日便可产下，多数产卵于幼果果蒂附近的产卵孔，一般每孔产1～3颗卵。遇到危险时反应灵敏迅速飞逃，同时该害虫还具有假死性，一般在夜里活动很少或者不活动，蛰伏于栗叶重叠处，趋光性不强[11-12]。昆虫的血细胞种类繁多，传统上根据血细胞的大小、组成以及功能来分类。近年来，开始应用基因标记等技术进行分类[13]。其血细胞中的浆细胞和粒血胞占很大比例，所以，这2种细胞同时也是栗实象甲免疫反应的2种重要细胞。正常生活的栗实象甲幼虫在3～6 h内体内血细胞数量呈上升状态且变化幅度不大。感染了白僵菌孢子原液的栗实象甲幼虫，起初由于体内免疫反应导致了血细胞数量的急剧增加，然后随着时间推移，在6～72 h血细胞数量急剧下降，经过72 h血细胞数量趋近于0，这时的昆虫致死率极高，72 h后尚存活的栗实象甲幼虫由于免疫系统较为强大，血细胞数量呈上升状态。感染了浓度为1.6×107孢子/mL的白僵菌孢子悬液的栗实象甲幼虫，起初由于体内免疫反应比正常生活的幼虫血细胞数量较多一些，直到72 h，血细胞数量与正常生活的幼虫较为相近，但是比正常生活的高一些，72～96 h体内血细胞数量缓步上升，96 h以后由于体内适应了白僵菌的感染，血细胞数量呈稳定上升状态。感染了浓度为8×106孢子/mL的白僵菌孢子悬液的栗实象甲幼虫，其血细胞数量走势也和前几种类似，在72 h之内血细胞数量呈下降状态，由于白僵菌孢子悬液稀释成8×106孢子/mL，几乎对虫体无影响，因此，72 h以后体内血细胞数量呈急剧上升状态，96 h以后血细胞数量缓慢减小。虫生真菌的优势在于，它可以直接进入昆虫的体腔，并在其体内发挥作用。因此，虫生真菌能侵染其他病原物不能侵染的害虫发育的各个时期。正因为这样，虫生真菌比大多数生物杀虫剂的效果都要好很多。

虽然虫生真菌的优势这么明显，但也不是所有的效果都很好，因为真菌需要发挥作用不仅只靠自身，而且也看环境和寄主是不是合适[14-15]。对于昆虫本身而言，真菌作为一种外来入侵物，一般都会使昆虫自身产生免疫反应，但效果不一定明显，也就是说昆虫体内的免疫系统不一定能把虫生真菌消灭。因此，一旦环境适合虫生真菌入侵到昆虫体内，昆虫自身的免疫反应很难发挥作用，但昆虫有时候能够通过自身的血细胞发挥作用，阻止孢子的萌发，降低感病概率[16]。