EMS诱变不同基因型花生品种的响应条件分析

杨秀丽，宁东贤，赵玉坤

（山西省农业科学院小麦研究所，山西 临汾 041000）

目前，国内市场绝大多数推广品种的亲本是伏花生和狮头企，或者是含有它们的血缘[1]。然而，过多使用遗传背景相同或相似的亲本材料，导致了栽培种花生基因的大量流失，其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，使得有性杂交重组中无法创造新的基因变异，优异性状的产生受到限制，无法获得在农艺性状和品质上突出的花生品种[2-3]。因此，在花生遗传育种工程中，需要一种有效方法来解决这些问题，创制出农艺性状优良、适应性强、配合力高和遗传基础广泛的优异新种质[4-5]。

通过化学剂诱导植物变异，短时间内可以获得大量变异性状，再经过选择育成新材料或新品种，这种方法产生了一般常规方法难以获得的新性状和新基因，具有独特的优势[6-7]。EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）是一种高效、稳定和良好的化学诱变剂，目前在诱变育种中应用最为广泛，效果也最好[8-9]。前人利用EMS在花生种质创新上取得了一些成果。SIVARAM[10]、朱保葛等[11]用EMS处理花生种子，均选育出高产品系。FANG等[12]通过EMS诱变处理花生种子，筛选出了1个油酸含量高达60%以上的弗吉尼亚型花生突变体e2-4-83-12。殷冬梅等[13]选择1片子叶但保留完整的胚作为种子外植体进行EMS诱变，确定了不同品种的适宜诱变组合。王传堂等[14]将EMS直接注入花生开放花朵的龙骨瓣内，获得了超大果和超小果的突变体，种子的蛋白质含量和粗脂肪含量有明显提高，油亚比也发生了改变。鲁花12号是用EMS处理杂交组合的F1果针诱变育成的[15]。

本试验利用EMS处理不同基因型花生品种的种子，以半致死剂量作为可遗传变异的选择依据，研究不同基因型对EMS的响应条件，以期获得最佳诱变剂量（浓度×时间）[16-17]，为后续处理大批量种子提供适宜的诱变条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试花生种子 供试花生材料为山西省3个主栽花生品种：普通型品种晋花8号，多粒型品种红四粒和珍珠豆型品种白沙1016，由山西省农业科学院小麦研究所花生课题组提供。

1.1.2 供试药剂 诱变剂EMS（甲基磺酸乙酯），由美国Sigma公司生产，为无色液体。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制 配制pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 1 000 mL：取 Na2HPO4·12H2O35.82 g定容 1 000 mL，NaH2PO4·2H2O 15.61 g定容 1 000 mL，从 1 000 mLNa2HPO4·12H2O中取 610 mL，1 000 mL NaH2PO4·2H2O中取390 mL，配制成 1 000 mL的磷酸缓冲液，用pH仪调pH值为7.0，备用。

配制0.5 mol/L硫代硫酸钠溶液1 000 mL：取Na2S2O3·5H2O124 g定容 1 000 mL，备用。

用蒸馏水浸泡种子9 h，以磷酸缓冲液作为溶剂，配制0.6%和0.9%等2个浓度的EMS溶液。

1.2.2 EMS诱变 试验设3个因素，分别是：A.品种（3个）；B.诱变浓度（2个水平）；C.处理时间（3个）。每个品种有6个处理剂量，分别是 B1C1，B1C2，B1C3，B2C1，B2C2，B2C3。试验因素及水平如表 1 所示。试验共18个处理，3次重复，以不添加任何溶液为对照（CK）。每份材料选取饱满种子350粒，每50粒装一瓶，在通风橱中按处理对每瓶进行浸种，标记。每个处理浸种结束后，在通风橱中加入0.5 mol/L的硫代硫酸钠，轻摇10 min，倒掉废液；流水清洗1 h；将种子平铺在湿润的滤纸上，保持种子透气。诱变处理第2天，把M0种子按小区种植，小区面积3.0 m2，株距0.2 m，行距0.4 m，每穴1粒。田间种植采用3因素完全随机区组设计，重复3次。

表1 试验因素及水平

1.3 测定项目及方法

播种后5 d观察植株出苗情况，每天早上记录出苗数，15 d后计算出苗势和出苗率。

出苗势＝第7天出苗数/种子总数×100%；出苗率＝第14天出苗数/种子总数×100%。

1.4 数据处理

采用Excel软件对初始数据进行平均数计算，采用SPSS 24.0统计软件对数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变对花生出苗的影响

经EMS诱变的花生种子在播种后出苗受到明显的抑制。图1显示，3个品种经诱变处理后，出苗起始和终止时间与对照相比均出现了延迟，出苗数也都明显降低。不同处理下各个品种的出苗趋势是不一致的，A1和A2在相同的浓度0.6%和浸泡时间5 h诱变处理（B1C1）下，最终的出苗数均超过了总数的1/2，说明在此条件下，植株的损伤程度和产生的变异程度相对较小，而之后的浓度与时间组合条件下，出苗数均没达到1/2，致死率较大，植株的受损率较高，后代产生的变异随之可能会较大。A3在不同的处理下，最后的出苗数均没有达到1/2，说明该品种在已有的试验条件下对EMS诱变响应条件敏感，容易受到损伤。

表2 3个基因型品种在不同诱变浓度和浸种时间组合下的出苗势情况 %

表3 3个基因型品种在不同诱变浓度和浸种时间组合下的出苗率情况 %

3个品种在不同诱变剂量下的出苗势和出苗率具体情况如表2，3所示。从表2可以看出，种子经诱变后其出苗势受到很大的影响，种子活力受损，萌发受到抑制。A1（晋花8号）在B2C1（浓度0.9%，时间5 h）的处理下，出苗势相对较强；A2（红四粒）和A3（白沙1016）在B1C1（浓度0.6%，时间5 h）的处理下，出苗势相对较强。从表3可以看出，在B1C1（浓度0.6%，时间5 h）的处理下，3个品种的出苗率均最高，A1和A2的出苗率＞50%，说明种子活力受损小，而A3的出苗率为40%，致死率相对高，说明A3对诱变剂反应敏感[18]。

2.2 品种、EMS浓度和处理时间对花生出苗影响的差异分析

本试验为3因素完全随机试验设计，为了研究这3个因素对出苗影响的差异性，对其进行了方差分析和多重比较。由表4可知，对于2个出苗指标来说，A因素、B因素、C因素、A因素×B因素、A因素×B因素×C因素的F值均达到显著水平（P＜0.05），说明每个因素对出苗势和出苗率的影响都是显著的。另外，不同浓度和浸种时间存在交互作用，不同品种、浓度和时间也存在交互作用，说明在同一浓度条件下，不同的浸种时间对出苗率的影响显著不同，而不同基因型的品种，在同样的浓度和时间水平下出苗率也是显著变化的。可见，不同基因型的花生品种对诱变剂的响应是不同的，而诱变剂浓度和浸种时间是否适宜对诱变效果影响非常大。

表4 3个因素对花生出苗率和出苗势影响的主体间效应检验

由表5可知，2个诱变剂浓度之间差异性极显著（P＜0.01），说明浓度越高，植株出苗率越低。当EMS浓度增高，植株受到的生理损伤也加大，致死率增大。表6显示，出苗率在3个时间水平下的表现是 C1＞C2＞C3，之间存在极显著差异（P＜0.01），说明浸泡时间越长，出苗率越低。

表5 比较2个诱变剂浓度水平对出苗率的影响

表6 比较3个浸种时间水平对出苗率的影响

从表7可以看出，不同基因型花生品种对诱变剂的响应存在极显著差异（P＜0.01），A1（晋花8号）是普通型品种，A2（红四粒）是多粒型品种，A3（白沙1016）是珍珠豆型品种，它们对EMS的敏感反应呈递增趋势。因此，不同的基因型品种有自身相应的最佳诱变剂量。

表7 比较3个不同基因型对出苗率的影响

2.3 确定EMS诱变的最佳剂量

不同的基因型品种具有不同的适宜剂量，确定最佳的诱变剂量是诱变育种成功的关键，在适宜剂量下，植株会产生更多新的变异，并保持自身的优良性状。通常把诱变处理后植株存活50%的剂量（半致死剂量，LD50）作为可遗传变异的选择依据，即最佳诱变剂量[19]。由表2，3可知，A1（晋花8号）在EMS浓度0.9%，浸泡时间5 h时，出苗率为38.6%，且出苗势最强；A2（红四粒）在EMS诱变剂量为B1C1（0.6%，5 h）时，出苗势最强，但出苗率为71.3%，没有达到半致死效果，而在EMS诱变剂量为B1C2（0.6%，7 h）时，出苗率为39.3%，出苗势仅次于B1C1处理；A3（白沙1016）在EMS浓度0.6%，浸泡时间5 h时，出苗率为40.0%，且出苗势最强。基于以上考虑，确定A1，A2，A3这3个品种的最佳诱变剂量分别为 0.9%，5 h；0.6%，7 h；0.6%，5 h。这可以作为之后大批量处理种子的诱变条件。

3 讨论

本研究利用EMS处理花生种子，以不同的基因型品种为试材，设计2个诱变浓度水平和3个浸泡时间水平，分析出苗势和出苗率。结果表明，EMS诱变剂损伤种子活力，抑制萌发；诱变浓度越高，出苗率越低，而浸泡时间越长，出苗率也越低；同一浓度水平上，浸泡时间越长，出苗率越低，而同一时间水平上，诱变浓度越高，出苗率也越低；不同基因型品种具有不同的诱变适宜浓度。诱变剂的浓度越高，对植株生理损伤越大，而长时间浸种导致种子种皮透性增强，使诱变剂与花生种子种皮内部结构接触充分，增强了抑制性。

化学诱变育种中最佳的诱变剂量既可以保证一定数量的突变体产生，又可产生更多的可遗传变异，因此，筛选适宜的诱变剂量是化学诱变育种的关键环节，一般以半致死剂量作为选择依据。本研究中，确定了晋花8号、红四粒和白沙1016的最佳诱变剂量分别是 0.9%，5 h；0.6%，7 h；0.6%，5 h。

利用筛选出的适宜剂量处理大批花生种子，经田间种植后，要对后代进行突变体筛选，需要通过对表型数据分析或利用分子生物学手段，建立突变体库，获得优异突变体，作为下一步选育或杂合的材料，最终选育出优异品种[20]。