样本资源库中肝病患者和HIV感染者外周血单个核细胞分离效果比较

孙坚萍，高梦丹，覃 岭，代艳超，乔桂芳，张永宏

转化医学是目前医学研究中的重点和热点，而样本资源库作为转化医学研究中的基石和重要组成部分，在疾病预防、个体化治疗上发挥着越来越重要的作用[1-2]。2009年，北京市科委正式启动疾病资源库项目建设工作。北京佑安医院以肝炎、艾滋病等传染病人群为主体，建立了肝炎/艾滋病传染病样本资源库[3-6]。

在肝炎/艾滋病传染病样本资源库中，外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是样本资源库储存的重要样本。从生物样本中提取PBMC是下游分析方法的必要前导环节之一。PBMC包括B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞等，在评价免疫反应中至关重要[7]，在疫苗研究[8-9]和临床试验[10-11]中也具有重要意义。这些后续的科学研究依赖于高质量的PBMC。本研究对样本资源库中肝病患者和HIV感染者这2组人群PBMC分离后细胞数量和细胞活力进行了检测分析，对从不同患者标本中提取PBMC有一定的借鉴意义，也为潜在的样本资源库质控的标准操作规程的制定提供了科学基础和依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 首都医科大学附属北京佑安医院2017年7月至2017年8月的标本，标本来源者均已签署知情同意书。根据疾病诊断分为肝病患者(乙型肝炎)、HIV感染者和正常对照(健康体检者)共121例，包括肝病患者35例[男18例，女17例，年龄(37.60±2.24)岁]，HIV感染者51例[男50例，女1例，年龄(33.80±1.29)岁]，对照35例[男8例，女27例，年龄(31.54±1.04)岁]。所有标本均为当天采集新鲜抗凝血，无手术期患者、无凝血等影响分离效果的标本。标本收集后立即进行PBMC的分离。

1.2 PBMC细胞分离 采集EDTA抗凝(货号367525，美国BD公司)外周血，Ficoll淋巴细胞分离液(货号AS1114546，挪威Axis-Shield公司)密度梯度离心法分离PBMC。 即将外周血离心后在距白细胞层5 mm左右停止血浆提取，使用无菌吸管向剩余标本中加入等体积RPIM-1640(货号SH30809.01B，美国Hyclone公司)培养基稀释，颠倒混匀；使用无菌吸管或滴管将上述稀释后血液小心的加入装有淋巴细胞分离液的离心管中(操作应轻缓，保持血液与淋巴细胞分离液界面清晰，避免混合)。标本置于离心机室温离心2 200 rpm 20 min。离心完毕后弃上清液，提取PBMC于离心管中，并加入适量RPIM-1640培养基混合均匀，进行细胞计数。其余细胞离心后冻存，存储于样本资源库中。

1.3 细胞计数 采用吖啶橙(acridineorange,AO)/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染液(货号CS2-0106-5ML，美国Nexcelom公司)对细胞进行计数，AO为浸润性染料(膜通透性)，可侵入活细胞与双链DNA结合发出绿色荧光、与单链DNA(变性DNA)结合发出红色荧光；PI为排斥性染料(膜不通透性)，不能进入活细胞，与死亡或正在死亡(膜通透性改变)的细胞的核酸结合，发出红色荧光。AO/PI双染色可以区分活细胞与死细胞。用细胞计数仪(Cell Counter，美国Nexcelom公司)进行细胞计数。即取20 μL细胞悬液，与AO/PI染料按1 ∶ 1比例混匀；取20 μL混匀液加入到细胞计数板(货号SD100，美国Nexcelom公司)中；将加入混匀液的细胞计数板插入到自动细胞计数仪中，计数活细胞数、总细胞数和细胞活性。

1.4 统计学处理 统计学分析和作图均使用GraphPad Prism 6.0软件。3组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用非配对t检验，计数资料组间比较采用卡方检验，相关性分析采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC分离效果与患者年龄的相关关系 对121例样本PBMC细胞分离后细胞浓度和患者年龄进行相关性分析，结果发现分离后活细胞浓度与年龄相关性无统计学意义(P>0.05)，分离后总细胞浓度和年龄相关性也无统计学意义(P>0.05)，图1。

A：活细胞浓度和年龄

B：总细胞浓度和年龄图1 细胞浓度和年龄间的相关性分析

2.2 不同人群PBMC分离效果比较 对3组人群PBMC细胞分离效果进行分析，分离后总细胞数浓度结果显示对照组分离细胞最多(1.54×106，9.03×105～3.53×106)，其次为HIV感染者人群(1.08×106，3.72×105～2.82×106)，最后为肝病患者(8.49×105，3.61×105～2.30×106，图2B)，3组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

分析活细胞结果显示对照组分离后活细胞浓度最高(1.53×106，8.79×105～3.51×106)，其次为HIV感染者人群(1.06×106，3.46×105～2.77×106)，最后为肝病患者(8.44×105，3.54×105～2.25×106，图2A)，3组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

分析分离后的细胞活性(图2C)，发现对照组细胞活性(98.40±0.39)高于肝病患者(97.28±0.33)和HIV感染者(96.86±0.37)，3组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 不同人群PBMC细胞分离效果比较

2.3 根据性别分组不同人群PBMC细胞分离效果比较 因为HIV感染者中50例为男性而且年龄偏低，在上述分组时性别和年龄在组间差异有统计学意义(P<0.05，表1)。为排除性别和年龄的影响，根据性别进行分组并剔除55岁以上的人群，对满足条件的13例肝病患者，50例HIV感染者，8例对照进行PBMC分离后活细胞浓度、总细胞浓度和细胞活性的比较。结果发现在全部是男性的人群中，3组人群之间在PBMC分离方面差异有统计学意义(P<0.05，表2，图3)。对照组在活细胞浓度和总细胞浓度方面最高，其次为HIV感染者，最后为肝病患者。而细胞活性也是对照组高于肝病患者和HIV感染者。另外，对女性人群进行分组分析(因HIV感染者只有1例，未进行分析)，17例肝病患者和27例正常对照之间进行PBMC分离后活细胞浓度、总细胞浓度和细胞活性的比较，也发现肝病患者分离效果低于正常对照组(P<0.05，表3，图4)。结果显示对照组分离后活细胞浓度和总细胞浓度均高于肝病患者。细胞活性虽然正常对照组也高于肝病患者，但无统计学意义。

表1 3组人群基本临床资料和PBMC分离效果比较

注：3组性别、年龄、活细胞、总细胞比较，均P<0.05

表2 55岁以下男性PBMC分离效果比较

注：3组活细胞、总细胞比较，均P<0.05

表3 55岁以下女性PBMC分离效果比较

注：2组活细胞、总细胞比较，均P<0.05

图3 男性人群中不同分组人群PBMC细胞分离效果比较

图4 女性人群中不同疾病人群PBMC细胞分离效果比较

3 讨论

佑安医院传染病样本资源库在建库时，对比国内外疾病资源库的建设状况，借鉴和吸收国际生物和环境样本库协会、世界经济合作与发展组织以及IS0 9001-2008质量标准的相关要求进行建库。目前佑安医院传染病资源库已成为国际生物和环境样本库协会会员，同时也通过了ISO9001质量认证。在佑安医院传染病样本资源库中，PBMC会涉及到后续细胞培养等实验，因此，所有标本在处理过程中，无论是否涉及传染性疾病，均在二级生物安全柜内进行，处理人员按照二级防护要求穿戴隔离衣、口罩、帽子、手套等。涉及传染病的标本其废弃物处理按照传染病废弃物处理原则进行集中消毒处理。

样本资源库中的样本质量对后续科学研究具有重要意义[12-13]。关于样本的处理有报道在不同处理时间、不同处理温度等条件下对血浆收集的影响，结果表明代谢产物与时间相关，随着时间延长代谢产物会增多[14]。在PBMC分离技术方法方面，有报道为利用PBMC从而进行下游应用研究，可以根据研究目的选择最佳的PBMC分离方法[15]。本研究主要对佑安医院传染病样本资源库中不同疾病人群的PBMC分离效果进行了比较。在检测方法上，本研究通过AO/PI染料对细胞进行双荧光染色，利用自动细胞计数仪进行计数，避免人为主观因素影响，并可以实现对样本快速大量的计数。以往常用细胞活性检测方法如台盼兰染色，耗时耗力，且较难达到精确计数。

从送入佑安医院传染病样本资源库中的标本中随机选择肝病患者、HIV感染者以及正常对照组，排除手术期患者、输液患者、溶血凝血等影响分离PBMC的患者，标本均为当天新鲜采集，室温放置。 分离PBMC都需要新鲜血液,最好不要超过24 h,佑安医院传染病样本资源库要求标本采集后6 h内进行PBMC分离。首先测量采集的外周血血量，再利用密度梯度法分离PBMC，计算每毫升外周血分离出的细胞浓度。结果显示(表1)3组人群PBMC细胞分离效果方面，对照组分离后不论是活细胞浓度还是总细胞浓度均为最高，其次为HIV感染者，最后为肝病患者。而细胞活性方面，对照组细胞活性高于肝病患者和HIV感染者。在全部为男性的分组中，也发现同样的趋势，即对照组在活细胞浓度和总细胞浓度方面最高，其次为HIV感染者，最后为肝病患者。而细胞活性也是对照组高于肝病患者和HIV感染者。在全部为女性的分组中，对照组分离后活细胞浓度和总细胞浓度均高于肝病患者，细胞活性虽然也高于肝病患者，但差异比较无统计学意义。

虽然PBMC细胞来源者存在个体差异，但是尽量选择年龄性别一致的3组进行比较。结果提示患有肝病和HIV感染的患者在分离PBMC方面均受影响，HIV感染者因HIV病毒感染的靶细胞为T淋巴细胞[16]，分离效果受影响可从该方面解释。肝病患者PBMC分离效果也受影响，有可能与肝病患者细胞免疫功能低下、体液免疫功能和细胞因子紊乱与亢进，免疫不平衡等所导致。国内研究显示乙肝患者外周血细胞数量降低，存在淋巴细胞亚群失衡和细胞免疫功能紊乱[17-18]。虽然不同疾病的患者PBMC细胞数量和活力有差异，在细胞冻存时，佑安医院传染病样本资源库根据细胞计数结果来冻存细胞，每冻存管中需要达到5×106细胞方可进行冻存。总之，研究结果为不同人群分离PBMC细胞研究提供了科学依据，对肝病患者和HIV感染者分离PBMC时应考虑其自身的疾病影响。