口蹄疫等动物疫病诊断技术研究进展

一、口蹄疫临床症状和发病及流行特点

口蹄疫是一种全球性传染病，传播无国界，可引起巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。对国家的政治、经济和社会有严重影响，故称为“政治经济病”。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的以偶蹄动物为主的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播迅速、发病率高，患病畜口腔黏膜、舌面、鼻镜、蹄叉、蹄冠部及乳头形成水泡和溃疡烂斑。

2010年4月，日本暴发O型口蹄疫，扑杀29万头家畜。国宝级肉牛品牌宫崎牛几乎绝种。损失800亿日元(合人民币62亿元)，丧失保持10年无FMD局面，畜产品被禁止出口。

（一）临床症状

急性经过持续一至数日，出现典型的临床症状；亚急性经过可持续2、3周。FMD发病初始，往往出现精神抑郁、发热、流涎、跛行，特征性症状是口、鼻、蹄及乳房等无毛部位出现水泡继而水泡破裂，形成溃疡、结痂，痂块脱落后形成斑痕，继而水泡破裂，形成溃疡、结痂，痂块脱落后形成斑痕。

（二）口蹄疫基本特点

1.FMD的易感动物种类繁多。包括20多个科70多个种的野生动物，重要经济畜种猪、牛、羊、鹿、骆驼等都易感，因动物价值高，扑杀病畜阻力大，补偿费用很大，欠发达地区FMD防治政策难以推进。

2.FMDV血清型多，血清型间不能交叉免疫。具有七个血清型，A、O、C、Asia1型和SAT1、SAT2和SAT3，型间不能交叉免疫保护，同型内不同病毒株的抗原性也有不同，免疫防治等于面对七种以上不同的传染病。

3.病原变异性极强。FMDV基因组具有小RNA病毒的特性，病毒变异性强。型内不同病毒株间的遗传变异可导致抗原差异，每逢新变异株的出现，就会导致一次新的疫情高潮。

4.FMDV的感染性和致病力特别强。极少量的病毒就能引起发病。牛只要吸入10个感染单位就可发病，病猪每天仅从呼吸道排出的病毒就高达108个感染单位，也就是说，一头病猪一天呼出的病毒如全被牛吸入，可使1百万头牛发病。

5.FMD有多种传播方式和感染途径。FMDV主要经由呼吸道、消化道和接触等途径感染；与感染动物、污染的动物产品、人员、污染物及装置的（直接或间接）接触都可感染。气象条件合适时，病毒可向下风方向传播几十甚至上百公里的距离，1981年，英国怀特（Wight）岛的牛被随风传送的法国布列塔尼（Brittany）发病猪产生的气溶胶病毒感染，病毒跨越英吉利海峡传播了250 km。

6.FMD的潜伏期短，发病急。动物感染病毒后最快十几小时就可发病排毒，感染动物能从多种途径分泌/排泄出大量病毒，大量动物被感染集中发病令人猝不及防。

7.与其它动物病毒相比，动物机体对FMDV的免疫应答程度较低。免疫动物及发病后康复动物，再次受到同源病毒攻击时部分动物有可能不保护；加强免疫接种也不能完全避免FMD临床病例的出现；疫苗免疫持续期短。

8.FMDV有较强的抵抗力和存活力。FMDV对外界环境的抵抗力很强，在自然情况下含毒组织和病毒污染的饲料、饲草、皮毛及土壤等可保持传染性达数周甚至数月之久。

9.可使反刍动物长期带毒。加强免疫接种也不能完全避免FMD临床病例的出现；被FMDV感染过的反刍动物会成为不表现临床症状的的持续性感染动物，是一个潜在的、引发疫病暴发的病毒传染来源。

二、口蹄疫检测技术

口蹄疫结构蛋白抗体检测方法包括口蹄疫阻断ELISA方法、口蹄疫单抗竞争ELISA方法、口蹄疫胶体金试纸条。

1. 液相阻断ELISA。1986年，Hablin等人以病毒中和实验（VNT）和液相ELISA实验原理，建立了液相阻断ELISA（LB-ELISA），主要用于检测血清中的FMD抗体。LB-ELISA现在是国际兽医局（OIE）颁布的标准检测方法，也是国际贸易指定的检测方法。

液相阻断ELISA的反应步骤优化。液相阻断ELISA抗原抗体反应是在血清稀释板上进行，37℃反应90 min或者4℃过夜，再转移至酶标板上被包被抗体所捕获，37℃反应60 min才能使抗原完全结合至酶标板上；而我们通过对反应体系的改进，抗原抗体反应在酶标板上进行，使抗原抗体的阻断反应和抗原的捕获在酶标上同时进行反应，极大的提高了反应效率。改进型液相阻断ELISA将液相阻断ELISA抗原抗体的反应时间从150 min优化至30 min，减少了反应时间和操作步骤，方便用户实验操作。改进型液相阻断ELISA试剂盒使用HRP标记的一抗用于检测阻断抗体，相比于液相阻断ELISA取消了酶标二抗的反应步骤，使反应步骤由两步简化为一步反应，反应时间由60 min减少为30 min。

2.口蹄疫分子诊断学方法。荧光定量PCR主要分为两大类，染料法和探针法。荧光探针是在探针的5’端标记一个荧光报告基团（R），3’端标记一个淬灭基团（Q），两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。

口蹄疫定型荧光定量RT-PCR试剂盒特点：（1）特异性好，覆盖面广，能够检测我国及周边国家目前主要流行毒株；（2）敏感性高，可以检测到10个拷贝/ul；（3）更加高效，能够在一个体系中同时鉴定目前在国内流行的口蹄疫三个型。

3. 口蹄疫单抗竞争ELISA抗体检测试剂盒。本试剂盒的判定标准是以病毒中和实验(VNT)为参照，经统计分析发现SPCE方法与VNT的相关性为0.93，其效价与中和效价高度相关，中和抗体与保护效力高度相关。检测结果既可定血清型，也可以定血清抗体效价。反应特点：（1）特异性好：血清型间，无交叉反应；（2）反应谱广：血清型内，与历史毒株和流行毒株都很好反应。检测特点：可测定血清型，也可测定抗体效价。

4. 口蹄疫非结构蛋白抗体检测方法。单抗阻断ELISA抗体检测方法、酶联免疫电转移印迹试验（EITB)或（FMDV Multi-NSPs Dot-blot）、2C3AB金标试纸条。

5. 口蹄疫分子诊断学方法。荧光定量PCR主要分为两大类，染料法和探针法。荧光探针是在探针的5’端标记一个荧光报告基团（R），3’端标记一个淬灭基团（Q），两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。

三、其他动物疫病诊断技术

1. 禽流感病毒H7N9（H7hi/H7lo/N9）三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。H7N9是A型流感病毒，属单股负链分节段RNA病毒，其基因组编码至少11种蛋白，主要包括表面基因HA和NA蛋白，以及6个内部基因蛋白。H7N9是新型重组病毒，其HA来源于H7N3，NA来源于H4N9等病毒，内部基因来源于H9N2亚型禽流感病毒，该病毒可引起人和鸡发病和死亡。

2. 猪病毒性腹泻的四重荧光定量RT-PCT。猪病毒性腹泻的病原种类繁多、感染状况错综复杂，猪肠道冠状病毒四重荧光定量RT-PCR试剂盒结合我国猪场病毒性腹泻最新流行特点，同时检测传统的猪传染性胃肠炎病毒、变异的猪流行性腹泻病毒，以及近年来新发的猪德尔塔冠状病毒和猪A型肠道冠状病毒。

优点：兼容性强、根据各类病毒保守基因全新设计；特异性高，不与其他病毒基因结合；敏感性好，可检测几十个病毒基因拷贝数；荧光信号强、类型通用，常规荧光定量PCR仪均可使用；程序简单、省时省力、精准高效。

3. 羊棘球蚴（包虫）病自然感染抗体ELISA检测试剂盒。利用蛋白质组学、代谢组学以及结合免疫学新技术，分离鉴定棘球蚴病特异性候选抗原；制备了羊棘球蚴病阳性、阴性血清；建立了羊棘球蚴病血清学间接ELISA诊断方法。

4. 猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒。优点：（1）相对于单抗阻断ELISA，该试剂盒具有更好的敏感性，排除了相对单一表位抗体丰度不足时引起的假阳性；（2）相对于国内其他试剂盒，大大缩短检测时间，2 h以内可完成检测；（3）该试剂盒具有较好的重复性，同一血清（n=48），板内变异系数CV＜8%，板间变异系数＜10；（4）能够准确、客观的反应免疫效果及血清中特异性猪瘟抗体的相对含量；（5）1 000份血清结果验证，与IDEXX、金诺阻断比对，整体符合率在85%-90%之间。

5. 布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒。布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒灵敏度达97.9%，是传统方法的5～10倍，适用于对可疑样品的检测特异性可达96.3%，能够有效区分与布鲁氏菌存在血清学干扰的大肠杆菌O157、耶尔森氏菌O9等阳性血清。

特点：（1）《2016-2020年度国家布病防控计划》已将竞争ELISA方法列入动物布病确诊检测方法之一；（2）本试剂盒即是通过特异性单克隆抗体与待检血清中的抗体，竞争性结合包被在ELISA板中的布鲁氏菌抗原；（3）由于其加入针对布鲁氏菌的单抗，与传统方法相比其灵敏度高、特异性强、适用于大部分易感动物如牛、羊等动物；（4）方法操作便捷、耗时短；检测使用酶标显色系统，结果易于判定。

四、兽医实验室诊断操作注意事项

（一）分子诊断实验室的规范化设置

1. 分成不同的工作区域。每一区域都须有专用的仪器设备，专用的加样器和枪尖等。标记清晰准确，如加样器或试剂等。单一方向顺序，从准备区、标本制备区、体系混合区及加样区。不同的区域推荐使用不同（颜色）的工作服。实验室的清洁应按试剂储存和准备区至加样区。不同区域使用各自的清洁用具。

2. 各区域的功能。（1）准备区功能：储存试剂的制备，试剂的分装；反应混合液的制备及分装；加阴性对照；（2）样本处理区功能：临床样本的处理（破碎）、保存；（3）核酸提取区功能：核酸提取及保存；（4）扩增区功能：将准备区分装好的反应体系和提取的核酸混合，并加阳性对照。

3. 准备区。（1）戴手套；（2）含反应混合液的离心管在解冻前都应快速离心数秒；（3）工作结束后，必须立即对工作区进行清洁，实验台面紫外照射半个小时以上；（4）实验室及设备的使用必须要有日常记录。

4. 样本处理区。（1）要正确使用加样器；（2）为避免样本间污染，最好不要同时打开多个样本；（3）对具有潜在污染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序；（4）用过的加样器枪头必须放入专门的消毒容器中。

5. 核酸提取区。（1）RNA标本使用的枪头离心管必须无菌且RNA-free；（2）工作台面必须洁净。用过的加样器枪头必须放入专门的消毒容器中；（3）实验结束及时进行清洁。

6. 扩增区。（1）将制备好的核酸加入反应混合液；（2）将阳性对照加入反应混合液；（3）需在超净台进行；（4）加好所有样品之后应快速离心数秒；（5）整个PCR过程在冰上操作；（6）混合体系加好后必须立即上机，不能放置。

（二）PCR污染与对策

1. 污染的预防。（1）PCR的前处理与后处理要在不同的隔离工作台上或房间内进行；（2）分装试剂，标记批号；（3）改进实验操作，带一次性手套、枪头，枪头不要暴露于空气；避免反应液的飞溅；操作多份样品时，要先将可混匀的成分一起制备成混合液；最后加入样品，并且在加入每一管核酸后，立即盖紧管盖；（4）检查结果的可重复性。

2. 污染源的追踪。常见的环境污染源有：加样器、清洁用具、离心机、枪尖、离心管、冰箱门把手。

3. 污染源的处理。（1）化学处理法：实验易污染的部位或器械可用1mol/L HCL擦拭核酸降解液（随时随地）；（2）紫外法：紫外线照射对于长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。

4. 因操作欠规范导致的问题分析。（1）仪器使用不当引起的污染问题：①离心机：必须配平；②移液器：严禁大力来回拧动，严禁调至容量之外使用，枪头应浸入液面2～3 mm处吸取，严禁将有液体的移液器平放或倒置，每周用75%乙醇清洗一次；（2）实验室布局不合理引起的污染问题：①样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片段均会通过空气进行传播；②仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公用，造成严重污染；③实验室操作垃圾乱放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室污染。

（三）血清学方法检测结果的影响因素

1. 试剂因素。试剂质量是影响检测结果的直接因素，其抗原抗体的纯度，标准品定值的准确性，抗体的亲和力、滴度和特异性，标记物的比活性或免疫活性等。均对测定结果产生直接影响。还有试剂盒的稳定有效期，运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度的影响。

2. 标本因素。（1）内源性因素：ELISA检测中会出现HOOK效应，主要是由抗原或抗体过量引起，在一步法反应中频繁出现。固相竞争ELISA克服了这种缺陷，但在检测猪血清过程中仍偶尔出现钩状结果，易出现假阴性结果。这是由于血清中内源性因子非特异性结合引起的，通过高倍稀释或加入百分之五的异源血清可以缓解内源性因子的干扰；（2）外源性因素：包括标本溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全和添加剂的干扰作用等。

3. 实验原理或操作方法。ELISA试剂盒操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。ELISA试剂盒操作大体分为四部分，以下叙述各个步骤中的影响因素。

（1）加样操作的影响：加样速度适中，避免加样于孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快或太慢，无法保证微量加样的准确性和均一性；加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应液界面有差异；

（2）温育的影响：温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2℃～8℃。温育时间不够，弱阳性标本检测不出；温育温度不够，弱阳性标本也难以检出；

（3）洗板的影响：在ELISA操作中，洗板是关键步骤之一，可除去样液中非特异性吸附在固相载体上的干扰物、游离的抗体和酶标记物，保证反应的定量关系，洗涤不充分直接影响检测结果的准确性、重复性，甚至“花板”导致整个试验失败。因此洗板次数、注水量应符合要求，洗板方法也要正确，洗板次数也并非越多越好，拍板用的纸重复使用也可能造成污染。洗板次数较少，造成残留，可引起假阳性结果；洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阳性结果。

（4）显色的影响：影响显色的关键是显色温度和显色时间，显色时间过长或过短均会造成弱阳性标本不能显色而导致假阴性发生。ELISA实验终止液反应后依然会引起颜色的持续变化，影响阴性和弱阳性样品及定量检测样品的结果，特别在大批样品需较长时间进行读数时，这种潜在的颜色逐渐变化现象成为结果影响的重要因素。

4. 环境因素。（1）通风、采光与防尘；（2）环境温度与湿度随地理位置不同可有很大差异应使用系统空调进行控温，并要求控制空气湿度为40%～70%之间；（3）稳定水电，实验过程中应采用蒸馏水(纯水)或经软化处理的自来水。