肝脂溶颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织TNF-α表达的影响※

隋晓丹

（长春中医药大学附属医院肝脾胃病科，吉林 长春 130021）

本实验通过观察肝脂溶颗粒对NAFLD模型大鼠肝脏组织TNF-α表达的影响，及肝脏组织TNF-α表达在非酒精性脂肪肝中的作用并探明调节其作用的传导途径，为中医临床干预治疗非酒精性脂肪肝提供理论依据和新的思路。

1 实验材料

1.1 实验动物 Wistar大鼠60只，雄性，体质量（200±20） g。

1.2 药物 肝脂溶颗粒：长春中医学院附属医院制剂室，批准文号：长卫制药字 (96)1367号。多烯磷脂酰胆碱胶囊：赛诺非安万特（北京）制药有限公司，批准文号：国药准字H20059010。

2 实验方法

2.1 非酒精性脂肪肝模型复制方法 大鼠适应环境1周后随机分为正常组9只、高脂组51只。正常组予普通饲料喂养，高脂组予高脂饲料（88%基础饲料、10%猪油、2%胆固醇）喂养，自由饮水。12周后随机选出7只大鼠（正常组1只，高脂组6只），处死后取肝脏组织进行HE染色，验证造模情况。

2.2 实验动物分组及给药方法 12周后，正常组大鼠普通饲料喂养同时每日生理盐水灌胃。高脂组大鼠随机分为模型组、多烯磷脂酰胆碱胶囊对照组（简称：对照组）、肝脂溶颗粒高、中、低剂量组（简称：高、中、低剂量组）。继续高脂饲料喂养同时每日给予不同药物进行灌胃（模型组：生理盐水灌胃1 mL/100 g；对照组：多烯磷脂酰胆碱胶囊水溶液灌胃，按0.14 g/kg体重给药；高剂量组：100%浓度肝脂溶颗粒水溶液灌胃，按3 g/kg体重给药；中剂量组：70%浓度肝脂溶颗粒水溶液灌胃，按2.1 g/kg体重给药；低剂量组：30%浓度肝脂溶颗粒水溶液灌胃，按0.9 g/kg体重给药）。连续灌胃4周后取材。

2.3 肝脏组织标本采集 腹主动脉取血处死大鼠，打开腹腔完整分离肝脏，快速取下肝脏组织一部分置于10%中性缓冲福尔马林溶液中（PH 7.4）固定，常规脱水后，石蜡包埋备用。

2.4 观察指标 免疫组化法检测肝脏组织TNF-α的表达。

2.4.1 免疫组织化学染色方法 石蜡切片常规脱蜡进水；热修复抗原；染色。

2.4.2 表达结果判定 在光镜下观察切片，根据免疫组化染色强度进行半定量判定。表达细胞的胞浆中可见棕黄色颗粒为阳性结果的判定标准，颜色越深，表示表达越强。如细胞胞浆中未出现棕黄色颗粒则为阴性结果。

TNF-α计分标准，按染色区变化和染色强度分为0～4分：0分：无染色或染色极弱。1分：局部弱染、染色区＜25%。2分：局部染色稍强、染色区25%～50%。3分：肝窦周围和汇管区染色增强，染色区50%～75%。4分：肝窦周围和汇管区染色呈强染，染色区＞75%。

2.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理数据，计量资料数据以均数加减标准差（±s）表示。

3 实验结果

正常组肝组织内偶见少量淡黄色颗粒，TNF-α蛋白表达极弱；模型组肝脏组织内可见明显增多的棕黄色颗粒，主要以汇管区和肝窦周围最为显著；其它药物干预组肝脏组织内棕黄色颗粒与模型组相比明显减少，表达强度也减弱，药物组中高剂量组肝脏组织内棕黄色颗粒相对较少，表达强度较弱；中剂量组与对照组相似，肝脏组织内棕黄色颗粒数量级表达强度均高于高剂量组；低剂量组肝脏组织内可见广泛黄色颗粒，表达强于其它药物干预组。

半定量评分结果示：各NAFLD模型组大鼠肝脏组织内TNF-α的表达明显高于正常组（P<0.01），差异具有统计学意义；模型组大鼠肝脏组织内TNF-α的表达明显高于各药物干预组（P<0.01），差异具有统计学意义；高剂量组大鼠肝脏组织内TNF-α的表达低于对照组（P<0.05），差异具有统计学意义；中剂量组大鼠肝脏组织内TNF-α的表达与对照组比较（P>0.05），差异无统计学意义；低剂量组大鼠肝脏组织内TNF-α的表达高于高、中剂量组及对照组（P<0.05），差异有统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠16周末肝脏组织TNF-α蛋白表达比较

图1 大鼠肝脏组织TNF-α表达免疫组化染色 （×200）

4 讨论

TNF-α是机体炎症反应和免疫应答反应的主要调节因子，TNF-α作为炎性细胞因子[1]可以通过增加氧自由基的产生和脂质过氧化[2]等方面引起脂肪性肝炎[3]和脂肪性纤维化。TNF-α还是NAFLD发病过程中胰岛素抵抗的一个关键性介质[4]，在脂肪组织中TNF-α水平与胰岛素抵抗呈正相关[5]，TNF-α主要通过干扰胰岛素信号转导、抑制葡萄糖转运、减少PPARγ的合成及调节FFA[6]参与介导肝脏及外周组织的胰岛素抵抗，还能够直接或间接损伤β细胞，导致胰岛素分泌缺陷。

刘铁军教授总结多年治疗非酒精性脂肪肝的临床经验，针对湿热瘀积证自研肝脂溶颗粒[7]，由决明子、枳椇子、泽泻等组成，诸药合用，共奏清热利湿、化瘀消积之功效。

实验结果表明肝脂溶颗粒能够显著降低大鼠肝脏组织TNF-α表达，进而减轻TNF-α对胰岛素信号传导的影响和其细胞因子的毒性作用，达到治疗NAFLD的目的。其疗效与剂量呈正相关，且对降低大鼠肝脏组织TNF-α表达疗效优于多烯磷脂酰胆碱胶囊。高脂饮食诱导致NAFLD大鼠肝脏组织TNF-α表达明显增高，这可能是大鼠引起非酒精性脂肪肝的机制之一，肝脂溶颗粒显著降低了肝脏组织TNF-α表达，因此，肝脂溶颗粒对非酒精性脂肪肝的防治作用可能是通过降低肝脏组织TNF-α表达而完成的。