基于组学及感官评价的酸奶风味研究

耿明雪，刘小鸣，赵建新，张灏，陈卫

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

酸奶是一种以牛奶为原料，经发酵后获得的一种发酵乳制品，目前市售酸奶多由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌亚种发酵而成。酸奶具有独特的风味，其风味物质包括挥发性物质和非挥发性物质。目前，大多研究只关注了酸奶中的挥发风味物质，对非挥发性物质的关注较少。

近年来，已经于酸奶中检测出超过90种风味物质，主要包括糖类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、含硫化合物、吡嗪类化合物和呋喃衍生物，通常认为乙醛和2,3-丁二酮(又称双乙酰)是酸奶的主要风味物质[1]。CHENG等人[2]发现，乙醛和双乙酰能分别赋予酸奶青苹果味和奶香味。但是SANDINE等人[3]发现发酵乳中过量的乙醛会产生强烈的“辛辣味”，过量的双乙酰也会引起不良口感。GALLARDO-ESCAMILLA等[4]利用部分最小二乘法设计模型尝试解析感官和挥发性化合物间的相互作用，推测与果味有关的挥发性化合物有3-庚酮、丙酮、2-丁酮、3-羟基-2丁酮。

目前，对发酵乳制品中非挥发性物质的研究多侧重于糖和有机酸方面。UPRETI等[5]用HPLC法测定了切达奶酪在后熟期内残余糖分以及水溶性有机酸含量。杨小琪等人[6]采用HPLC方法检测酸奶中的9种有机酸含量，但未同时测定酸奶中糖类物质及其他非挥发性物质的含量。GC-MS衍生化法已被[7]应用于检测微生物细胞中碳代谢的数百种代谢物(氨基酸、非氨基有机酸、磷酸化有机酸和脂肪酸中间体)。因此可以将GC-MS硅烷化衍生法应用于酸奶非挥发性物质的分析中。

本文选取了10种常见市售酸奶，采用组学的研究手段对其挥发性物质和非挥发性物质进行全面测定，并进行感官评价分析。利用偏最小二乘法分析市售酸奶风味感官与挥发性物质的相关性，采用冗余分析法分析其滋味感官与非挥发性物质的相关性，解析了酸奶风味形成对应的风味化合物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

从本地超市购买A、B、C、D、E、F六个厂家的10种酸奶为实验材料，其中原味酸奶样品编号为CA1、CB1、CB2、CC1、CC2、CD1、CE1、CF1；老酸奶编号为CA2、CC3。样品储存于实验室4 ℃冰箱中，各项指标均在保质期内测定。

1.1.2 试剂

NaCl、无水CuSO4、浓H2SO4、95%乙醇、无水乙醚、石油醚(30～60 ℃沸程)、K2SO4、NaOH、酚酞，均为分析纯；甲醇、癸酸乙酯(99%，内标)、吡啶、核糖醇(纯度>97%，内标)、甲氧胺盐酸盐、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，99%)，均为色谱纯。

1.1.3 仪器与设备

凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司；恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；气相色谱三重四级杆质谱联用仪GCMS-TSQ 8000 Evo，美国赛默飞世尔科技公司；80 μm CAR/PDMS萃取头，美国Sigma公司；冷冻浓缩离心干燥，美国LABCONCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 感官评价

1.2.1.1 评价员的筛选与培训

鉴于感官实验的持久性，评价员的招募和筛选主要针对食品专业在校学生。按照GB/T 16291.1—2012[8]中所述方法，分别对评价员的基本味道识别能力、观察阈、识别阈进行测定，最终确定12个感官灵敏的候选人，男女比例是1∶1。参考ELORTONDO等人[9]的方法对评价员进行基本知识及评价方法的培训。感官描述词来自感官分析术语[10]、文献中词汇[11-12]。按照国标[13]对评价员进行一致性训练，每周培训2次，持续2周。

1.2.1.2 酸奶感官描述词

经感官培训后最终确定酸奶气味感官评定词为甜味、酸味、奶香味、乳脂味、果香味、青苹果味、香草味、蒸煮味、乳粉味、硫味；滋味感官评定词为甜味、酸味、涩味、奶香味、乳脂味、果香味、青苹果味、香草味、蒸煮味、乳粉味、硫味、不洁味、不自然感。对上述描述词进行定义并确定参照样，如表1所示。

表1酸奶风味感官描述词
Table1Descriptivesensorylanguageofyogurt

描述词定义参照样甜味是由糖类的水溶液产生的一种基本味道16 g/L的蔗糖水溶液酸味是由酸性物质的稀水溶液产生的基本味道,舌黏膜受到氢离子的刺激引起的0.08%的柠檬酸水溶液奶香味双乙酰物质产生的味道双乙酰,20 μg/L蒸煮味煮牛奶的味道,牛奶热变性产生巯基引起的把牛奶加热到85℃持续30 min硫味含硫化合物的味道煮熟捣碎的鸡蛋水果味牛乳中的嗜冷菌繁殖所分泌的丁酸酯、异戊酸酯和己酸酯的积累引起的青苹果味酸奶中含有的乙醛物质,使酸奶具有新鲜的青苹果味乳粉味乳清粉的香气5 g乳清粉溶解到100 mL的水中乳脂味牛奶中脂肪相关的香气

1.2.1.3 样品的制备

挑选使用透明带盖的食品级塑料杯，称取20 g酸奶样品放入2个品尝杯中，分别进行气味、滋味感官评定。每次试验鉴评的酸奶样品数量控制在5个以内，样品编号采用3位随机数字。评价员每品尝完一个样品后用矿泉水漱口，每个样品重复两次。感官评分标准(0～9)：0(无)；1～3(较弱)；4～6(中等强度)；7～9(强)。

1.2.2 挥发性风味物质分析

参照SETTACHAIMONGKON等人[14]的方法利用SPME-GC-MS技术测定酸奶中挥发性风味物质并略作修改。室温下称取6 g酸奶样品装入20 ml萃取瓶中，同时加入1 g NaCl和2 μL 0.05 mg/mL癸酸乙酯的甲醇溶液。采用固相微萃取方法提取酸奶中的风味成分，萃取探头是涂抹厚度为85 μm的CAR/PDMS，自动进样器将萃取探头插入密封的萃取瓶后，萃取头暴露在样品上部的空气中，于50 ℃、条件下萃取30 min，解吸5 min，进行GC-MS分析。

气谱条件：Rtx-WAX毛细管(30 m×0.25 mm，0.25 mm)；进样口温度225 ℃，分流比10，流速1 mL/min，载气为氦气；程序升温：初始温度30 ℃，保持3 min；15 ℃/min升温至225 ℃，保持5 min。

质谱条件：离子化方式EI，发射能量为70 eV，发射电流为200 μA，检测器电压为1.4 kV，离子源温度240 ℃，接口温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z30～500。通过NIST 2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，并采用峰面积归一化法定量。

1.2.3 非挥发性物质分析

参照ZHAO等人[15]的方法测定酸奶中非挥发性风味物质并略做修改。取30 mg冻干的酸奶样品放入2.5 mL的离心管里，加入1 mL甲醇溶液、10 μL 2 mg/mL内标物质核糖醇溶液振荡，12 000 r/min离心15 min，取0.5 mL放入1.5 mL离心管，用真空离心浓缩仪旋干，待样品旋干后进行衍生化处理，加入100 μL 10 mg/mL甲氧羟胺吡啶，40 ℃ 90 min金属浴，再加入40 μL BSTFA振荡，75 ℃ 60 min金属浴。用12 000 r/min 15 min离心，取上清，转移到气相瓶中(程序1：移60 μL到带内插管的气相瓶中；程序2：用二氯甲烷稀释100倍移1 mL到气相瓶中)，待测。

气相色谱条件及升温程序：Rtx-5MS毛细管(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升温1：柱初温70 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，以90 ℃/min 升至320 ℃；程序升温2：柱初温70 ℃，以30 ℃/min升至230 ℃，以90 ℃/min 升至320 ℃，保持3 min；载气(He)流速35.0 cm/sec，进样量1 μL；分流进样：1∶10。

质谱条件：电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度300 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z33～600。由GC-MS得到的谱图，在NIST 2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，并采用峰面积归一化法定量。

1.3 数据分析

应用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行统计差异性分析；应用SIMCA-P+11分析软件对感官数据进行主成分分析(principal component analysis，PCA)；对感官数据与挥发性风味物质进行偏最小二乘法分析(partial least squares regression，PLS)；应用Canoco分析软件对非挥发性风味物质和滋味感官进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 结果与讨论

2.1 酸奶感官分析

2.1.1 酸奶气味特征分析

市售酸奶的气味感官分析结果如表2所示。气味感官分析数据显示了不同市售酸奶之间的风味差异。市售酸奶奶香味指标评分为3.7～5.6，果香味指标评分为1.3～3.4，青苹果味指标评分为1.2～2.8，蒸煮味评分为1.7～4.2，硫味评分为1.0～2.3，乳粉味评分为1.3～4.2，喜好性评分2.8～6.7。市售酸奶中奶香味处于中等强度，果香味、青苹果味弱，且还存在弱的蒸煮味、硫味、乳粉味。据评价员气味感官喜好性表明，样品CA1、CE1、CF1喜好性高；CA2、CB1、CB2、CC2、CE1喜好性适中；样品CC1、CC3喜好性低。

表2 市售酸奶气味感官评定结果Table 2 The results of descriptive aroma attributes of commercial yogurt

注：不同字母表示同一列数据之间存在显著性差异(p<0.05)，n=12

采用PCA对酸奶气味特征进行分析，前3个因子的特征值之和占总特征值的88.0%，能够解释原变量的大部分信息。由表3可知，第1主成分(PC1)重点反映了果香味、青苹果味、香草味、喜好性4个指标的变异信息，且都处于PC1轴的正方向，特征向量值均大于0.6，这表明喜好性与果香味、香草味成主要正相关，与蒸煮味、硫味、乳脂味成主要负相关；第2主成分(PC2)重点反映了甜味、奶香味、乳粉味3个指标的变异信息，甜味、乳粉味处于PC2的正方向，奶香味处于PC2的负方向更接近于喜好性；第3主成分(PC3)重点反映了酸味1个指标的变异信息，发酵形成酸奶的过程中，牛奶中的乳糖会被分解成乳酸，生成的乳酸进一步代谢生成各种酸味化合物，赋予了酸奶特有的酸味[17]。综上所述，酸奶以青苹果味、奶香味、酸味为香气主调，评定员偏向于青苹果味、奶香味的酸奶。

表3 主成分载荷矩阵Table 3 Component Matrix

2.1.2 酸奶滋味特征分析

市售酸奶的滋味感官分析结果如表4所示。滋味感官分析数据显示了不同市售酸奶之间的滋味差异。市售酸奶甜味评分4.7～6.2，酸味评分5.9～8，奶香味评分为4.8～6.4，果香味评分为1.8～4.2，青苹果味评分为1.8～3.5，蒸煮味评分为1.9～4.0，硫味评分为0.6～2.8，不自然感1～3.4，喜好性评分为3.2～8。市售酸奶甜味、奶香味处于中等强度，硫味较弱，酸味、果香味、青苹果味、蒸煮味、不自然感略有差异。据评定员滋味感官喜好性表明，样品CA1、CB2、CA2、CF1喜好性高；样品CB1、CC2、CE1喜好性适中；样品CC1、CC3、CD1喜好性低。

表4 市售酸奶滋味感官结果Table 4 The results of descriptive taste attributes of commercial yogurt

注：不同字母表示同一列数据之间存在显著性差异(p<0.05)，n=12。

表5 主成分载荷矩阵Table 5 Component Matrix

采用PCA对酸奶滋味特征进行分析前三个因子的特征值之和占总特征值的80.6%，能够解释原变量的大部分信息。由表5可知，第1主成分(PC1)重点反映了甜味、果香味、青苹果味、涩味、乳脂味、不自然感、蒸煮味、硫味、不洁味9个指标的变异信息，特征向量值均大于0.6。其中甜味、果香味、青苹果味和喜好性处于正方向，表明与喜好性呈显著正相关；而涩味、乳脂味、不自然感、蒸煮味、硫味、不洁味处于负方向，说明与喜好性呈显著负相关；第2主成分(PC2)重点反映了酸味、奶香味2个指标变异信息，特征向量值均大于0.6，且酸味、奶香味均处于正方向，与喜好性呈显著正相关；第3主成分(PC3)重点反映了不自然感1个变异信息，与喜好性呈显著负相关，可能为了弥补酸奶风味物质不足而添加了香精等物质。酸奶的气味和滋味感官信息表明评定员更喜欢果香味、奶香味较强的酸奶，而目前大多数市售酸奶香味、果香味较弱，有些酸奶还具有较强的不佳风味，降低的酸奶的品质。

2.2 感官特性与风味物质的相关性分析

2.2.1 气味感官特征与挥发性风味物质的相关性分析

采用SPME-GC-MS分析酸奶中主要的挥发性风味物质，共鉴定出23种物质，其中包括醛类4种、酮类7种、酸类6种、酯类2种、含硫化合物3种、醇类1种，各种市售酸奶中挥发性风味物质含量如表6所示。从表6中数据得知，乙醛含量为4.66～23.0 μg/kg，丙酮含量为3.55～30.66 μg/kg，2,3-丁二酮含量为43.41～180.97 μg/kg，乙酸乙酯含量为0.16～6.57 μg/kg。

表6 市售酸奶的挥发性风味物质含量 单位：μg/kg

注：不同字母表示同一行数据之间存在显著性差异(p<0.05),n=3

A-市售酸奶气味感官PCA分析图; B-市售酸奶气味感官和挥发性风味物质PLS分析(代表市售酸奶气味感官属性； 代表市售酸奶挥发性风味物质属性)图1 市售酸奶气味感官特征与挥发性风味物质相关性分析图 Fig.1 Correlation analysis between aroma feature and volatile compounds of commercial yogurt

将市售酸奶气味感官数据与挥发性风味物质数据进行最小二乘法分析，如图1-A所示。从该图可以看出，样本点分布在椭圆内，不存在特异性，模型的拟合效果较好，R2X[1]=0.548 988，R2X[2]=0.227 783能够反映大部分样品信息，精度较高。从图1-B可以看出，喜好性与果香味、青苹果味、香草味、奶香味呈正相关，与硫味、蒸煮味、乳脂味呈明显负相关。2,3-丁二酮贡献酸奶的奶香味和香草味；乙醛贡献了酸奶的青苹果味；丙酮、2-丁酮、酯类贡献了酸奶的果香味；乳酸主要贡献酸奶的酸味；己酸、癸酸能够产生乳脂味；硫化物产生了硫味和蒸煮味。与OTT[18]和CHENG等人[2]研究结果一致。

从图1中A、B可知，CA1、CB2、CE1的喜好度较高。这3种酸奶样品的乙醛含量在13.2～23.09 μg/kg，2,3-丁二酮含量118.34～180.97 μg/kg，处于酸奶风味的中等强度，且3种酸奶中含硫化合物的含量相对低；CC1、CC2酸奶的喜好性低，酸奶中硫化物含量为1.60～6.12 μg/kg，相对较高，硫化物含量可以影响评价员对酸奶的喜好性。

综上所述，奶香味、青苹果味为酸奶的典型香味，分别与双乙酰、乙醛密切相关。酸奶生产过程中，还会产生一些不佳风味如蒸煮味、乳脂味、硫味等。其中蒸煮味与二甲基二硫醚密切相关；乳脂味与有机酸有关；硫味与三甲基硫醚有关。评定员更喜欢果香味、奶香味的酸奶，而具有明显蒸煮味、乳脂味、硫味的酸奶不受欢迎。

2.2.2 滋味感官特征与非挥发性物质的相关性分析

10种市售酸奶样品中的非挥发性物质结果如表7所示。检测出20种主要的非挥发性物质，其中有机酸3种、醛类物质1种、糖类物质12种、醇类物质2种、其他物质3种。酸奶中主要的有机酸物质包括乳酸、硬脂酸。乳酸可以促进乳蛋白的吸收；抑制肠内病原微生物的生长[19]。从表7可以得出酸奶中乳酸的含量为105.69～262.64 mg/100g，酸奶样品CA1、CC1、CC3、CD1乳酸含量较高，CB1、CC2、CE1酸奶乳酸含量较低。酸奶中主要特征糖类物质有蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖、半乳糖、阿拉伯糖、L-(+)-苏阿糖、D-(-)-赤藓糖，酸奶中乳糖含量大约为2%～4%。从表7也可以得出酸奶中乳糖含量为1 745.7～4 936.2 mg/100g，蔗糖含量为484.7～1 588.6 mg/100g，其乳糖含量与WU等人[20]实验结果一致。酸奶的制作过程中会加入一定量蔗糖，调节甜酸比提高酸奶品质。除此之外，醛、醇类物质也是酸奶重要的滋味物质，其中由乳酸菌代谢甘油三酯产生的丙三醇是酸奶中特征性的甜味物质。

表7 市售酸奶的非挥发性物质含量 单位：mg/100g

注：不同字母表示同一行数据之间存在显著性差异(p<0.05)，n=3。

将市售酸奶的滋味感官和非挥发性物质做冗余性分析结果如图2-B所示。从滋味感官角度分析，喜好性与甜味、果香味呈正相关，与涩味、酸味、乳粉味、乳脂味呈负相关，且滋味强度越强并不一定受到评定员喜爱。大多数评定员更偏向于滋味温和的甜味、果香味酸奶。

A-市售酸奶滋味PCA分布图；B-市售酸奶滋味感官和非挥发性物质RDA分析图图2 市售酸奶滋味感官特征与非挥发性物质相关性分析图Fig.2 Correlation analysis between taste feature and non-volatile compounds of commercial yogurt

从图2-B中可以看出，乳酸是酸奶酸味的主要来源；在检测到的10种糖类物质中，蔗糖和半乳糖与甜味的对应性最高；D-(+)-葡萄糖醛酸γ内酯能赋予酸奶果香味。从图2-A中可以看出，酸奶样品中CA1、CB1、CE1受到评定员喜爱。CA1、CB1、CE1样品中D-(+)-葡萄糖醛酸γ内酯的含量分别为13.36 mg/100 g、17.28 mg/100 g、 18.88 mg/100 g，该样品中含有的D-(+)-葡萄糖醛酸γ内酯比其余样品高；CA1、CB1、CE1样品中滋味感官甜酸比大约为0.9时更受欢迎。

3 结论

从感官、风味物质方面分析表明市售酸奶之间存在差异。感官评定员对市售酸奶喜好性主要受奶香味、果香味、青苹果味、酸味、甜味、蒸煮味、硫味、乳脂味、乳粉味影响。从市售酸奶样品中共检测出23种挥发性风味物质，其中丙酮、2-丁酮、酯类贡献了酸奶的果香味；乙醛贡献了酸奶的青苹果味；2,3-丁二酮贡献酸奶的奶香味和香草味。从市售酸奶样品中共检测出20种非挥发物质，包括酸类、糖类、酯类等。乳酸是酸奶酸味的主要来源；在检测到的10种糖类物质中，蔗糖和半乳糖与甜味的对应性最高；D-(+)-葡萄糖醛酸γ内酯能赋予酸奶果香味。