橙酒酵母的分离、筛选及鉴定

贾瑞楠，单万祥，李永仙，郑飞云，刘春凤，王金晶，钮成拓，李崎

(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

甜橙是柑橘的一种，属于芸香科柑橘属植物，在国内具有广泛的种植区域。甜橙含有多种对人体有益的营养物质，包括维生素、氨基酸、柠檬苦素、矿物质等[1]。目前，甜橙主要以鲜食为主，易致甜橙产量呈季节性过剩，进而造成极大的浪费。市场上甜橙的加工产品种类较少，主要集中于橙汁、果酱等，其附加价值较低，出口渠道较为单一。将橙汁发酵为橙酒能够保留橙汁中多种营养成分[2]，不仅丰富了甜橙产品市场，并有助增加其产品的附加值，进而有效帮助解决甜橙因季节性过剩造成的浪费问题。

近年来，以水果为原料，经酿造具有独特水果风味的果酒受到越来越多消费者的青睐，然而橙酒在市场上比较少见，产品多采用葡萄酒酵母发酵或者直接用食用酒精加橙汁经调配勾兑而成，因而产品无典型性、缺乏浓郁香气、口感欠协调，风味欠优雅。对于果酒酿制而言，菌株发酵性能的优劣直接关系到其代谢产物的种类和含量，因而对产品的口感和风味起着非常关键的作用。不同的水果其物质组成和含量也具有很大的差异，因而在发酵时对酵母菌株的性能需求也会不同。筛选出1株适合橙酒发酵的专用果酒酵母显得尤为重要[3]。据文献报道，潘训海[4]、陈瑶[5]以自然环境为分离源从菌种发酵性能方面筛选出适用于橙酒发酵的酵母，得到1株产酒精体积分数达7.5%、残糖量低于3 g/L、品评结果较好的菌株，取得了初步成果。熊元林[6]、罗佳丽[7]等侧重于酵母耐受性的研究，得到1株对酸的耐受能力为pH 2.5、酒精耐受力为10%、氯化钠耐受力为11%的酵母。目前对于橙酒酵母的研究多为发酵性能和耐受能力，尚处初步阶段。缺少发酵风味方向的橙酒酵母筛选工作。

本研究利用橙汁自然发酵，从中分离筛选得到1株酵母菌株，该菌株发酵能力旺盛，果酒口感协调，风味柔和。文中同时对发酵风味进行了分析和探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜橙、蔗糖，市售；偏重亚硫酸钾(K2S2O5，分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；酵母基因组提取试剂盒，南京优尔博生物科技有限公司；富集培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，氨苄1[8]；YPD培养基平板(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，琼脂粉20。发酵培养基：橙汁，调整糖度为22 °Bx。

1.2 仪器与设备

电子天平(PL2002)、AL204分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；阿贝折光仪，上海豫光仪器有限公司；生化培养箱(BSP-250)、低温水浴槽，上海博讯公司；气相色谱串联质谱联用仪，美国瓦里安(Varian)公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种分离

将成熟的鲜橙榨汁后装入无菌的三角瓶内，于28 ℃静置自然发酵。当橙汁发酵液出现大量的气泡时，取10 mL发酵液加入已灭菌的富集培养基中，于28 ℃培养48 h，取100 μL菌液逐级稀释后涂布于含有氨苄的抗菌YPD平板上(每个梯度3个平行)，将稀释的菌液均匀涂布在放置于28 ℃恒温培养箱培养48 h，观察菌落生长情况。典型的酵母菌落表面光滑湿润，呈乳白色，有酒香味[9]。将培养后的平板中具有典型的酵母菌特征的单菌落挑出，进一步在YPD平板中进行二次划线分离，将得到的单菌落分别经YPD液体培养后于-80 ℃条件下保藏备用。

1.3.2 菌种初筛

吸取100 μL于-80 ℃条件下保藏的菌液入10 mL的YPD培养基中，活化18 h后，将菌液以3%(以橙汁体积计)的接种量接入橙汁发酵培养基中，观察橙汁进行杜式小管[10]的发酵情况。选择产气旺盛并且香气优良的菌株用以下一步复筛。

1.3.3 菌种复筛

将初筛保留的菌株于YPD培养基中活化18 h后以3%的接种量接入22 °Bx的橙汁中，于25℃恒温发酵7 d。根据GB/T 15038—2006中的方法测定每株酵母发酵所得橙酒的酒精度[11]，每个样品均做3次平行试验，并进行初步的感官评定。

1.3.4 菌种的三级筛选

(1) 酵母pH耐受力实验

以柠檬酸调节橙汁的pH值为2.5、3.0、3.5、4.0，采用杜氏管发酵，观察各菌株在不同pH值条件下的杜氏小管产气情况，每个样品均做3次平行试验。

(2) 酵母SO2耐受力实验

将橙汁中添加不同量的K2S2O5以调节SO2质量浓度为50、100、150、200、250 mg/L，采用杜氏管发酵，观察各菌株在不同SO2质量浓度下的杜氏小管产气情况，每个样品均做3次平行试验。

(3) 菌株发酵液风味分析[12-13]

将复筛得以保留的菌株进行活化，以3%的接种量接入含糖量22 °Bx的橙汁中，于25 ℃恒温发酵7 d。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)半定量的方法分析检测橙酒中的风味成分，实验以2-辛醇作为内标。

发酵液前处理萃取条件为：将3.0 g NaCl加入20 mL干净无异味的顶空进样瓶中，加入8 mL发酵后的橙酒，20 μL内标。45 ℃预热5 min，萃取60 min。萃取结束后，250 ℃解吸附5 min。分析条件与参考文献[13]相同。

1.3.5 菌株鉴定

从-80 ℃甘油管中取100 μL接种到已灭菌的YPD培养基中，28 ℃、120 r/min培养18 h。取适量培养液离心1 min(12 000 r/min，4 ℃)，弃上清液，获得适量菌体，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组。用酵母ITS通用引物扩增18S rDNA，PCR反应条件与参考文献[13]相同。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并进行DNA测序。并采用MEGA5.0软件将测序所得的序列与GenBank中酵母菌的18S rDNA序列进行分析，获得系统发育树。本研究选取了3种酵母菌：Saccharomycescerevisiae(39、KCCM200270、JCABSC21、CGMCC 2.1423),Candidacylindracea(NRRL Y-17506、JCM 9586),Schizosaccharomycespombe,Schizosaccharomycespombe(KCTC 7522)。

1.3.6 感官品评[14]

组织品评小组(具有相关专业背景的教师6人和硕士研究生14人组成)对橙酒进行感官品评，取平均值。主要从外观、香气、风味和典型性4个方面评价。外观:果酒清亮透明、有光泽无悬浮物和沉淀物，满分20分；香气:果香、酒香皆浓馥幽郁，诸香和谐纯正，满分30分；风味:酒体醇厚丰满或酒体爽口，风味协调，满分40分；典型性:具有明显橙酒特征，具有浓郁发酵果酒香味，且酒香纯正优雅，满分10分。

1.3.7 数据分析

PCA可以描述主要成分以及数据的趋势和可能的分类，是一种有效的数据分析工具。本文使用SPSS 20.0软件对不同酵母的发酵香气进行PCA分析，并且对数据进行统计和差异性分析，显著性界值为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 菌种分离

市售甜橙榨汁后，自然发酵2 d，将发酵液稀释后在抗菌平板中进行分离纯化，如图1所示，共得到酵母菌株80株。

图1 橙汁发酵液中富集的酵母Fig.1 Enriched yeast in orange juice fermentation broth

2.2 菌种初筛

采用杜氏小管发酵对分离得到的酵母进行初筛,初筛结果见表1。25 ℃恒温发酵48 h后，观察杜氏小管内的产气情况。结果显示其中气体全部充满小管的有50株并且具有淡淡的酒香，这说明了这些菌株有较强的发酵能力；其中44株酵母的发酵气味优良，具有明显的橙香。因此，保留发酵能力旺盛，发酵气味良好的酵母菌株共44株。

表1 酵母初筛结果Table 1 Results of yeast screening

注：“-”表示气体不足杜氏小管的1/3体积或发酵液有酸败的气味；“+”表示气体超过杜氏小管的1/3或发酵气味无酸败气味；“++”表示气体超过杜氏小管的2/3或发酵气味优良。

2.3 菌种复筛

将初筛得到的44株菌株进行三角瓶发酵，25 ℃恒温发酵7 d。发酵结束后采用比重瓶法[11]测定其酒精度。各菌株的发酵情况显示较大的差异性，酒精度最高可达11.75%，最低可达2.52%。乙醇体积分数大于8%的菌株共有16株，经初步的感官品评后，保留酒精度高，同时品评结果良好的酵母菌株9株，继续进行三级筛选。

2.4 菌种的三级筛选

为了进一步筛选得到性能优良可用于橙酒发酵的菌株，对复筛得到的菌株的耐酸能力，SO2耐受能力，及风味物质进行测定，并以商用葡萄酒酵母D254作为对照。

2.4.1 菌株耐酸能力实验

橙汁pH值较低，本实验为评价酵母在低pH值条件下的耐受性,选择了4个梯度的pH值，结果如表2所示。实验结果显示复筛所得的酵母表现出较强的耐酸能力,和商用葡萄酒酵母D254相当,此轮筛选保留所有菌株。

表2 酵母对pH耐受性筛选Table 2 pH tolerance ability of different yeasts

注：“+”表示气体超过杜氏小管的体积的1/2；“++”表示气体超过杜氏小管的2/3；“+++”表示气体充满杜氏小管，表3同。

2.4.2 菌株耐SO2能力实验

通常,SO2添加到果汁中可以起到杀菌效果,降低微生物对酵母的不良影响[15]。在葡萄酒的生产中，应用SO2抑制各类杂菌的生长和繁殖。但过量的SO2会影响到酵母的生长,使葡萄酒的发酵周期延长,并使成品具有苦涩感。GB2760—2014中SO2(SO2残留)的最高使用剂量为0.25 g/L[15]。实验结果如表3所示,5、8、14、15、20、26号菌株对SO2的耐受性很好，在250 mg/L含量中仍发挥产气功能,与商用葡萄酒酵母D254相当。

表3 酵母对SO2耐受性筛选Table 3 SO2 tolerance ability of different yeasts

2.4.3 菌株发酵液风味分析

果酒的风味物质对于果酒香气和酒体的平衡至关重要，也是评价果酒品质的重要指标。醇类、酯类、萜烯类、酸类、酚类化合物是果酒中重要的风味物质，它们赋予了果酒水果、花香等复杂的香气[16]。将5、8、14、15、20、26、D254菌株进行三角瓶发酵，采用GC-MS半定量的方法检测橙酒中的风味物质及其含量。表4为不同酵母发酵液的风味物质指标,将不同酵母发酵的各类风味物质指标经SPSS 20.0软件作PCA分析，如图2所示，主成分1的贡献率达到73.5%，20号菌株、D254与主成分1有很高的正相关，5、8、14、15、20、26菌株与主成分1有很高的负相关，可以反映出20号菌株和D254与其他菌株的风味差异显著。

将有显著差异的20号菌株与其他菌株比较，如表4所示，20号菌株发酵液各项风味物质含量高于5、8、14、15、26菌株发酵液。同时，相比于葡萄酒酵母D254,20号菌株发酵液的各类物质增幅分别为总醇50.49%，总酯24.85%，萜烯类化合物31.67%，酸类化合物44.71%，酚类化合物59.30%，仅酮醛类化合物略低于D254的发酵液，经SPSS差异显著性分析后，20号菌株和D254菌株在酮醛类化合物质量浓度上并无显著差异。同时，7株菌株发酵橙酒的感官评分无显著差异。保留20号菌株进一步分析。

表4 不同酵母发酵的橙酒的各类风味物质的质量浓度Table 4 Concentrations of various flavors of orange wine fermented by different yeast

注：同一列中不同字母表示显著差异(p<0.05)。

图2 不同酵母发酵的橙酒的主成分分析Fig.2 Principal compoment analysis of orange wine fermented by different yeast

为进一步探讨各风味组分对于酒体的贡献，本研究采用OAV值来评价香气组分对于酒体的贡献程度。OAV值是指挥发性物质的质量浓度与其阈值的比值[17]。OAV值大于1的物质对于酒体有贡献。OAV值越大，其对于酒体的贡献程度越大[18]。橙酒共检出近50种香气组分，其中异戊醇、正庚醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸、芳樟醇、β-大马酮、α-松油醇、月桂烯的香气活力值大于1，这可能是橙酒风味的的重要香气组分。酯类物质中辛酸乙酯、癸酸乙酯有浓郁的水果香气，是果酒中重要的一类香气物质[19-20]，辛酸、乙酸苯乙酯具有花香香气。比较20号菌株与葡萄酒酵母D254发酵液中的挥发性物质的OAV值，如表5所示，20号菌株各种香气组分均大于D254，所列成分中唯β-大马酮的OAV值略低于D254。经SPSS 20.0软件作统计学分析，20号菌株与对照菌株D254发酵橙酒的异戊醇、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯的OAV值呈极显著差异，癸酸乙酯的OAV值呈显著差异。

表5 橙酒中挥发性成分的OAV值(仅列出OAV>1的香气成分)Table 5 OAVs of odorants of different orange wines (odorants with OAV above 1.0 were listed)

注：**表示在p<0.01水平上极显著差异；*表示在p<0.05水平上显著差异。

综合以上结果，20号菌株较适合橙酒的酿造，发酵后的橙酒口感清新，香气馥郁。

2.5 菌种鉴定

20号菌的基因组DNA经提取、PCR扩增及电泳检测，如图3所示，结果显示良好。将扩增产物测序，所得的序列与GenBank中酵母菌的18S rDNA序列用MEGA5.0进行分析，获得系统发育树。如图4所示，20号菌株与酿酒酵母(S.cerevisiae)系统位置最为接近，说明20号菌株属酿酒酵母属。同时，测序结果经与NCBI数据库中BLAST序列比对，发现20号菌与1株酿酒酵母S.cerevisiae(ID：MG101836.1)具有100%的18S rDNA基因序列相似度，由此可确定20号菌株为酿酒酵母。

1-20号菌株；Y-阴性对照；M-Marker图3 酵母PCR产物琼脂糖电泳图Fig.3 PCR products by agarose electrophoresis of yeast

图4 基于18S rDNA测序构建酵母菌株系统发育树Fig.4 Phylodenetic tree of S. cerevisiae based on 18S rDNA sequencing

3 结论

选择果酒发酵的酵母的必要条件包括良好的发酵性能，耐受性强，尽可能的生香能力，发酵产品香气丰富协调。目前学者对橙酒酵母的筛选多侧重于发酵性能和耐受性能。本文在借鉴前人的基础上，在进行发酵性能和耐受力筛选后，针对发酵风味对酵母进行了进一步筛选，得到1株发酵能力强、发酵后口感柔和、香气浓郁的橙酒专用酵母，编号为20。

该菌株在含糖量22 °Bx橙汁中，产酒精能力可达11.75%，在pH 2.5，SO2250 mg/L的条件下仍具有良好的发酵能力，与文献报道中[6]筛选得到的产酒精能力为11.4%，耐受pH 2.5的橙酒酵母相当。在针对发酵风味的菌株筛选中，20号菌株发酵液的醇类、酯类、萜烯类、酸类、酚类化合物的质量浓度均高于商用酵母D254，且与D254在OAV值比较中，除β-大马酮略低于D254，其余物质OAV值均高于D254。经18S rDNA测序及系统发育树分析，鉴定其为酿酒酵母(S.cerevisiae)。

橙酒专用酵母菌株的获得有助于橙汁果酒的改善，为果酒的开发生产奠定了研究基础。