乳酸菌细菌素对小鼠肠道菌群结构及代谢产物的影响

俞赟霞，王刚，赵建新，张灏，陈卫

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

人类的肠道菌群是一个密集、复杂和动态的微生态系统[1]，肠道菌群与宿主健康密切相关[2]。二者相互作用以维持微生态系统的功能稳定性。此外，肠道菌群产生的代谢产物(主要为短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs))是肠道菌群与宿主进行“交流”的物质基础[3]。研究发现，乳酸菌可改善肠道环境，促进宿主健康，其产生的抗菌物质也是其发挥益生作用的一个重要因素[4]。乳酸菌产生的抗菌物质有有机酸[5]、过氧化氢[6]、双乙酰[7]、细菌素[8]等。其中，细菌素是一类由核糖体合成，经或不经过修饰酶加工，最后分泌至细胞外的一类能抑制或杀死其他细菌的抗菌肽。

自Nisin[9]被发现以来，细菌素一直是多个科学领域的研究热点。研究表明，有多种乳酸菌可产生细菌素，其具有狭窄或广泛的抑菌谱[8]。近年来，国内外大多数关于细菌素的研究主要集中于以下4个方面：①产细菌素乳酸菌的挖掘以及细菌素抑菌能力的分析[10]；②将产细菌素乳酸菌运用于食品加工制造，以控制食品体系菌群及抑制致病菌生长[11]；③用作抗生素的替代物[12]，以在尽可能减少对肠道菌群干扰的条件下治疗致病菌导致的感染，包括一些耐药性致病菌[13]；④对细菌素进行生物工程改造[14]。而关于乳酸菌原位产细菌素对肠道菌群结构与代谢产物的影响仍少有研究。DZUNG等人[15]研究了5种产Ⅱ型细菌素的乳酸菌对肠道菌群结构的影响，结果表明乳酸菌是否产细菌素对门水平上的小鼠肠道菌群基本无影响，但属水平上的肠道菌群结构发生了短暂但有利的改变。PAUL等人[16]的研究结果表明，除明显减少了螺旋体门菌群，产与不产细菌素Abp118的唾液乳杆菌对小鼠与猪的肠道菌群结构在主要门水平上无显著影响。前人研究均未涉及对肠道菌群代谢产物的影响以及抑菌谱大小对肠道菌群的影响是否存在差异。

本研究通过筛选产细菌素的乳酸菌，并选择合适的相应不产细菌素的乳酸菌作为阴性对照株，以探索乳酸菌所产细菌素对宿主肠道菌群结构与代谢产物的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

本研究所用的乳酸菌及其他微生物菌株的编号、种属、来源及培养方式分别见表1，表2。

表1 研究所用的乳酸菌菌株信息Table 1 Information of lactic acid bacteria used in this study

表2 研究中涉及的指示菌菌株信息Table 2 Information of indicator strains used in this study

1.2 试剂与仪器

1.2.1 培养基与试剂

胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)，MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司；胰蛋白酶(1∶250)，木瓜蛋白酶(>6 000 U/mg)，国药集团化学试剂有限公司；胃蛋白酶(1∶15 000)，过氧化氢酶(>3 000 U/mg)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸链球菌素(Nisin，1 026 U/mg)，美国Sigma公司；胆盐(OXOID)，英国OXOID公司；细菌基因组提取试剂盒FastDNA®SPIN Kit for Feces，北京联立信生物技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA收试剂盒TIANgel Mini Purification Kit，天根生化科技(北京)有限公司；QuantTMdsDNA BR Assay Kit，美国Life Technologies公司；KAPA Biosystems Library Quantification Kit，美国KAPA Biosystems公司；TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit、MiSeq®Reagent Kit，美国Illumina公司。

1.2.2 仪器

电子天平，pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；高压蒸汽灭菌锅MLS-3750，日本Sanyo公司；冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司；快速核酸提取仪FastPrep-24，美国MP公司；Bio-Rad T100 PCR仪，核酸电泳仪，凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；厌氧工作站，英国依莱泰科公司；恒温恒湿培养箱，上海森信实验仪器有限公司；超净工作台，生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)，TRACE 1300，赛默飞世尔科技公司；MiSeq测序仪，美国Illumina公司。

1.3 菌株的培养

将待活化的乳酸菌以体积分数为2%的接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃置于厌氧工作站中培养20 h，活化3代后将菌液离心(8 000 r/min，20 min)，取发酵上清液，调节上清液pH值为6.00±0.05[10]。经0.22 μm无菌滤膜过滤后得到无菌的发酵上清液，备用。

所用的指示菌按照表2中的条件进行活化培养，备用。

1.4 牛津杯双层平板法测定乳酸菌的抑菌能力

制备含指示菌的固体培养基，调节菌浓度为106～107CFU/mL。在铺有一层水琼脂的平板中摆上牛津杯，小心倒入含指示菌的培养基，待其凝固后拔出牛津杯[17]。在形成的孔中加入100 μL制备好的无菌上清液，4 ℃条件下扩散4 h，随后37 ℃静置培养16～18 h，观察并测定抑菌圈的大小。每个样本做3个平行实验，以MRS液体培养基(pH=6.0)作为阴性对照，Nisin溶液(活力为510 U/mL)作为阳性对照。

1.5 乳酸菌抑菌物质的分析

为测定抑菌物质对过氧化氢酶与蛋白酶的敏感性，将过氧化氢酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分别溶解于50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0，胃蛋白酶为pH=2.0)中配成母液，加入至乳酸菌发酵上清液(pH调至7.0或2.0)中，使最终酶质量浓度达到1 mg/mL[11]。37 ℃水浴2 h后取出，100 ℃煮沸10 min使酶失活，将发酵上清液pH值调回6.0，按照1.4中的步骤测定其抑菌能力。

1.6 乳酸菌生物学特性的测定

1.6.1 乳酸菌代时的测定

将待测定的乳酸菌活化3代后，按体积分数为2%的接种量接种于适宜培养基中，混匀后分装至25个无菌试管中，适宜条件下进行培养。指数期每隔30 min进行1次活菌计数，其余时间段为60 min测定1次(每次计数取1根试管)。绘制活菌数随时间变化的生长曲线，按照公式(1)计算乳酸菌的代时(G)。

式中：t2与t1，指数期分别所取的时间点2与1，h；N2与N1，分别对应时间点2与1时的活菌数，CFU/mL。

1.6.2 乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定

实验方法参照翟齐啸[18]并稍作修改，将胃蛋白酶溶于生理盐水中(质量分数为0.85%)，调节pH至3.0，使其终质量浓度为3 g/L；将胰蛋白酶溶于生理盐水中(质量分数为0.85%)，调节pH至8.0，使其终质量浓度为1 g/L，随后加入牛胆盐使其终质量浓度为3 g/L。人工胃、肠液经0.22 μm无菌滤膜过滤后备用。将活化3代后的待测乳酸菌离心(5 500 r/min，15 min)，重悬于人工胃液中并进行初始活菌计数，37 ℃培养3 h后再次测定其活菌数(期间每隔30 min摇匀1次)。将含菌人工胃液离心(5 500 r/min，15 min)，重悬于人工肠液中，37 ℃培养2、4 h后测定其活菌数(期间每隔30 min摇匀1次)，计算乳酸菌的存活率。

1.7 动物实验

1.7.1 动物饲养及分组

实验动物选择5周龄的C57BL/6雄性小鼠30只，分为5组，每组6只。饲养环境温度为20～26 ℃，湿度40%～70%，每周更换2次垫料。每日每只小鼠灌胃的菌浓度为5×109CFU/mL，灌胃体积为200 μL，即每只小鼠每天的灌胃菌量为1×109CFU。实验分组及处理方式见表3。

表3 实验动物分组及处理方式Table 3 Design of animal experiment

注：对小鼠进行乳酸菌灌胃前先适应1周。

1.7.2 小鼠粪便菌群结构的测定

动物实验期间，收集灌胃3周后与停止灌胃1周后的小鼠粪便，采用16S rDNA扩增子测序的方法分析粪便菌群结构。按照FastDNA®Spin Kit for Feces试剂盒说明书来提取小鼠粪便的基因组。以提取得到的基因组为模板，经PCR扩增16S rDNA的V3、V4区(扩增片段长度为465 bp，上游引物341F：CCTAYGGGRBGCASCAG，下游引物806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT)。PCR反应体系组成为TaqMix，25 μL；341F，1 μL；806R，1 μL；模板，1 μL；ddH2O，22 μL。反应条件为：95 ℃，5 min；(95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，30 s)30个循环；72 ℃，7 min；12 ℃，10 min。经琼脂糖凝胶电泳切取对应条带，按照TIANgel Mini Purification Kit试剂盒说明书进行胶回收。

采用Qubit DNA浓度测定方法利用QubitTMdsDNA BR Assay Kit测定样品浓度。根据DNA定量结果进行等质量浓度混样，随后按照TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit 试剂盒说明书构建文库，最后根据MiSeq Reagent Kit说明书经Illumina MiSeq测序仪上机测定[20]。

1.7.3 小鼠粪便短链脂肪酸的测定

实验方法参考毛丙永[20]等并稍作修改：小鼠粪便经冻干后，称取20 mg粪便置于EP管中，加入500 μL饱和NaCl溶液，浸泡30 min后用组织破碎仪破碎至无明显颗粒状。加入20 μL 质量分数为10%的H2SO4酸化，漩涡振荡30 s，加入800 μL乙醚，振荡混匀，提取短链脂肪酸，漩涡振荡30 s后，14 000 r/min离心15 min。取上层乙醚相，在上清中加入0.25 g无水硫酸钠，14 000 r/min离心15 min，将上清液转移至棕色进样瓶中，用GC-MS测定。

GC-MS测定条件按王刚等人[5]的方法进行，分析采用离子扫描模式(扫描范围为m/z60、74、88、73、43、87、28)，采用外标法计算粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)的含量(μmol/g)。

1.8 数据处理及分析

本研究所有数据分析均由GraphPad Prism 6、SPSS 19.0、Excel 2010处理完成。实验结果以“平均值±标准差”表示，利用单因素方差分析(ANOVA)两两比较中的Duncan法进行分析，p<0.05则认为存在显著性差异。

2 结果

2.1 乳酸菌的抑菌能力

7株乳酸菌的抑菌结果如表4所示。结果表明，4株乳酸片球菌中仅CCFM 28具有抑菌能力且抑菌谱较宽，其表现出对单核细胞增生李斯特菌ATCC 19114较强的抑菌能力(抑菌直径为16.7 mm)。3株格氏乳杆菌中仅JCM 11657表现出抑菌能力，但其抑菌谱较窄，德氏乳杆菌乳亚种JCM 1557与CGMCC 1.2142对其敏感性最高(抑菌直径为16.3 mm)。

表4 七株乳酸菌的抑菌能力Table 4 Antimicrobial ability of 7 strains

注：牛津杯外径大小为8 mm。

2.2 乳酸菌的抑菌物质分析

过氧化氢酶与蛋白酶对乳酸菌发酵上清液的影响如表5所示。结果表明过氧化氢酶对CCFM 28与JCM 11657产生的抑菌物质基本无影响，但CCFM 28和JCM 11657的发酵上清液对1～2种蛋白酶较敏感(抑菌圈变为8 mm)。因此，可以判断CCFM 28与JCM 11657产生的抑菌物质主要为细菌素。

表5 过氧化氢酶与蛋白酶对发酵上清液抑菌效果的影响Table 5 Effects of proteases and catalase on the antibacterial effect of supernatant

注：测定蛋白酶、过氧化氢酶对CCFM 28发酵上清液的影响，所用的指示菌为ATCC 19114，而JCM 11657用的则是JCM 1557。

2.3 乳酸菌生物学特性的分析

7株乳酸菌的生长曲线和代时测定结果分别见图1和表6，耐酸耐胆盐结果如图2所示。综合这3个实验结果，发现ZT-45和JS-SZ-1-5的生物学性质分别与CCFM 28和JCM 11657最为接近。因此，选择这2株菌分别作为CCFM 28和JCM 11657的不产细菌素阴性对照菌株。

图1 七株乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of 7 strains

菌株编号菌株名称代时G/hCCFM 28ZT-45X1339-1乳酸片球菌(P. acidilactici)0.4020.3530.3940.342JCM 11657JS-SZ-1-5JS-WX-9-1格氏乳杆菌(L. gasseri)0.6490.6330.906

图2 七株乳酸菌的耐酸耐胆盐能力Fig.2 Resistance of 7 strains to gastric acid and bile salts

2.4 乳酸菌对小鼠生理的影响

2.4.1 小鼠饮水量和摄食量

动物实验期间，按时测定小鼠的饮水量(每日)和摄食量(每周)，实验结果见图3-A、图3-B。结果显示，小鼠的饮水量与摄食量呈现出相似结果，CCFM 28组与ZT-45组明显低于对照组、JCM 11657组和JS-SZ-1-5组(p<0.05)，而CCFM 28组与ZT-45组，JCM 11657组与JS-SZ-1-5组之间无显著差异(p>0.05)。因此，从本结果来看，乳酸片球菌或格氏乳杆菌是否产细菌素对宿主饮水量、摄食量的影响无显著差异，但菌种差异会引起饮水量与摄食量的变化。

图3 小鼠的饮水量和摄食量Fig.3 Water and food intake of mice

2.4.2 小鼠体重

每周测定小鼠体重，计算其体重增量，结果如表7所示。从中发现组别之间基本无显著差异(p>0.05)，但CCFM 28组与ZT-45组的体重增量基本低于对照组和格氏乳杆菌JCM 11657组和JS-SZ-1-5组。综合2.4.1的结果，摄入乳酸菌可能会影响小鼠的摄食量与饮水量，但对体重增量影响较小，且可能与乳酸菌是否产细菌素无关。

表7 小鼠的体重增量Table 7 Increased weight of each mouse

注：a，b，c代表同一时间测定的5个组别体重增量的差异分析。

2.5 乳酸菌对小鼠肠道菌群的影响

2.5.1 乳酸菌对小鼠肠道菌群结构的影响

灌胃3周后(时间点1)与停止灌胃1周后(时间点2)的粪便菌群组成变化如图4～6所示。

图4 灌胃3周后不同组别的小鼠粪便菌群的门水平变化Fig.4 Changes in the phyla level of fecal microbiota in different groups after gavage for 3 weeks

图5 停止灌胃1周后不同组别的小鼠粪便菌群的门水平变化Fig.5 Changes in the phyla level of fecal microbiota in different groups after 1 week of withdraw

图6 两个时间点收集的小鼠粪便菌群中厚壁菌门与拟杆菌门比例的变化Fig.6 Changes in the levels of Firmicuts and Bacteroidetes in feces of mice at 2 time points

结果发现，2个时间点测得的粪便菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例总和占肠道菌群总数的90%以上(图4和图5)。从厚壁菌门水平上看(图6-A，图6-C))，除CCFM 28组，2个时间点的其余组别均与对照组存在显著差异(p<0.05)，表明ZT-45，JCM 11657，JS-SZ-1-5可显著减少宿主肠道厚壁菌门的比例，而CCFM 28对其影响较小。另外，从拟杆菌门水平上看(图6-B，图6-D))，其呈现出与厚壁菌门类似的结果，ZT-45，JCM 11657，JS-SZ-1-5可显著提高拟杆菌门的比例，而CCFM 28组与对照组之间的差异逐渐减小(从时间点1至2)。此外，CCFM 28组与ZT-45组之间存在显著差异(p<0.05)，而JCM 11657组与JS-SZ-1-5组之间则无明显差异(p>0.05)，这可能与乳酸菌所产细菌素的种类和抑菌谱的大小有关。

2.5.2 乳酸菌对小鼠肠道菌群代谢产物的影响

2个时间点测定的小鼠粪便中代谢产物(主要为短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸与丁酸)的含量结果如图7所示。实验结果表明，乙酸、丙酸、丁酸以及总酸的含量与对照组相比无显著差异(图7，p>0.05)，且CCFM 28组与ZT-45组，JCM 11657组和JS-SZ-1-5组之间亦不存在显著差异(p>0.05)。此外，对比2个时间点所测得的相应SCFAs含量，发现二者之间无显著差异(p>0.05)。由此说明，肠道菌群代谢产物与灌胃的乳酸片球菌、格氏乳杆菌是否产细菌素无关，且亦可能与以上两个菌种差异无关。

图7 灌胃3周后与停止灌胃1周后小鼠粪便中短链脂肪酸含量的比较Fig.7 Comparison in the level of SCFAs in feces between the groups of gavage for 3 weeks and withdraw for 1 week

3 讨论

细菌素被认为是乳酸菌发挥其益生作用的潜在因素之一[21]。近年来，国内外对产细菌素的乳酸菌对宿主肠道菌群的结构与代谢产物的影响则少有研究，特别是产细菌素的乳酸菌对肠道菌群代谢产物的影响，所产细菌素抑菌谱的大小对菌群的影响是否存在差异等还未有报道。

本研究采用牛津杯双层平板法结合过氧化氢酶、蛋白酶处理等方法，得到两株所产抑菌物质主要为蛋白或多肽类的乳酸菌——乳酸片球菌CCFM 28和格氏乳杆菌JCM 11657。并通过生长速率以及耐酸耐胆盐能力选择与CCFM 28和JCM 11657生物学性质最为接近的乳酸片球菌ZT-45与格氏乳杆菌JS-SZ-1-5分别作为其阴性对照组，以研究产细菌素的乳酸菌对宿主肠道菌群结构与代谢产物的影响。

结果显示，乳酸片球菌组的饮水量和摄食量明显低于对照组与格氏乳杆菌组，但产与不产细菌素组别之间无显著差异。对于小鼠体重增量，乳酸片球菌组的体重基本低于对照组与格氏乳杆菌组，但无显著差异。由此说明，对小鼠饮水量、摄食量以及体重增量的影响与摄入的乳酸菌是否产细菌素无关，但可能与菌种差异有关。此外，摄入乳酸片球菌后引起宿主饮水量与摄食量的改变，而体重未受影响可能与摄入的乳酸菌会影响宿主能量的吸收与利用有关[22]。

灌胃3周后与停止灌胃1周后的粪便菌群结构测定结果表明，小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门与拟杆菌门构成。ZT-45，JCM 11657，JS-SZ-1-5可显著减少宿主肠道厚壁菌门的比例，并提高拟杆菌门的所占比例，而CCFM 28对两者的影响较小。有研究结果[15,24]表明，在体外Pediocin PA-1对21种常见的肠道菌群基本无影响，且产或不产细菌素Pediocin PA-1的乳酸片球菌P.acidilactici347在门水平上基本不影响Balb/c小鼠的肠道菌群，与本研究结果不一致的原因可能是研究模型的选择，实验动物品系的差异以及乳酸菌灌胃时间的长短。此外，CCFM 28组与ZT-45组之间存在显著差异，而JCM 11657组与JS-SZ-1-5组之间无明显差异，这可能与乳酸菌所产细菌素的种类和抑菌谱的大小有关[25]。因此，乳酸菌所产细菌素的种类与抑菌谱的大小可能会影响小鼠肠道菌群结构。

研究表明，肠道菌群能分解利用可溶性纤维产生有益代谢物质(主要为乙酸、丙酸、丁酸)以促进机体健康[23]。短链脂肪酸的测定结果显示，产与不产细菌素组别之间，乳酸菌组与对照组之间，不同乳酸菌组别之间，两个时间点的相应组别之间均不存在显著差异。根据前人的研究结果[26-27]显示，L.gasseriPA 16/8在MRS培养基中经发酵后可产生超过120 μmol/L的丁酸。产细菌素的P.acidilacticiUL5与对应的不产细菌素菌株相比，可在人类回肠末端模型中使菌群产生更多的乙酸与丙酸。但可能因研究模型与乳酸菌生长代谢环境的不同，使得本研究结果与前人发现有所不同。因此，尽管摄入乳酸菌对正常宿主肠道菌群的影响在门水平上有明显变化，但不足以引起菌群代谢产物的显著改变，表明正常宿主的肠道菌群具有较强的功能稳定性。

综上所述，2对乳酸菌(CCFM 28与ZT-45，JCM 11657与JS-SZ-1-5)对小鼠饮水量与摄食量的影响与其是否产细菌素无关，但与菌种差异有关，而饮水量与摄食量的改变并未引起小鼠体重增量的明显变化。乳酸菌是否产细菌素、所产细菌素的种类和抑菌谱的大小均可能会影响小鼠肠道菌群结构，但不显著影响短链脂肪酸含量。