还原型谷胱甘肽在果酒酿造中的应用

徐俊南，王 静，常婷婷，樊明涛*

（西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的同时具有γ-谷氨酰基和巯基的活性三肽[1]，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。在生理条件下，90%以上的谷胱甘肽都是以GSH形式存在[2]，氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）的含量不足10%。GSH与GSSG在一定条件下可以相互转化，两分子的GSH可在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下脱氢缩合以二硫键相连形成GSSG；相反，GSSG可在谷胱甘肽还原酶和还原型辅酶Ⅱ的作用下被还原成GSH[3]。对谷胱甘肽的研究绝大多数都是关于GSH的，因为GSH具有较强的生理活性，它的主要作用有抗氧化、解毒、清除自由基、抗辐射和维护蛋白质及免疫系统的正常功能。GSH在临床医学上可用作解毒药物，在治疗肿瘤、抑制艾滋病病毒等方面也有应用；近期，在化妆品和食品领域中的应用成为研究热点[4]。

发酵型果酒是以水果为原料，通过酵母发酵及其调配而成的一种低度饮料酒，常见的有葡萄酒、荔枝酒、猕猴桃酒、桑葚酒等[5]。发酵型果酒因直接采用果汁或者果浆进行发酵，其特点就是风味独特并且拥有较低的酒精度，而且能较好地保存水果中的氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，某些香气成分如挥发性硫醇、高级醇类和酯类还有所增加，深受消费者的欢迎[6-7]。但是果酒酿造过程中容易出现果汁的氧化和褐变，香气成分丢失和有机酸含量过高等问题。

为解决上述问题，人们在酿酒实践中不断探索。目前比较常用的方法是在果酒酿造过程中添加二氧化硫以达到提升酒的抗氧化能力、防止褐变以及抑制杂菌的目的，但是二氧化硫具有一定的毒性和刺激性，含量过高则会危害人们的身体健康，导致中毒、昏迷等症状[8]。随着生活水平的提高，人们开始寻求更健康的饮食，二氧化硫含量较低的果酒为大多数消费者所接受。因此，寻找一种添加剂来减少甚至替代二氧化硫的使用势在必行[9]。虽然GSH作为一种添加剂来处理待发酵的果汁和果酒还处于试验阶段，但是它的潜在作用不容忽视，它与二氧化硫在抗氧化方面具有协同作用，这在一定程度上可以减少二氧化硫在果酒中的使用，有助于生产高品质果酒[10-11]。

2015年，第38届世界葡萄与葡萄酒大会在德国美因茨召开，此次大会通过的两项决议都是关于添加GSH处理葡萄汁和葡萄酒，并且规定了GSH的最大添加量为20 mg/L，以此来补充葡萄汁本身含有的GSH或补偿酿酒过程中损失的GSH，为生产安全健康的高品质葡萄酒以及其他果酒提供了科学的指导[12]。目前，对于GSH的研究多集中于对其生产条件的优化和含量检测等方面，而对于它作为一种添加剂用来提升果酒品质的研究并不多见。基于此，该文全面地总结添加GSH对果酒品质特性的影响，为GSH广泛用于果酒酿造奠定了理论基础。

1 果汁和果酒中的GSH

目前，对于果汁中GSH含量的研究多集中于葡萄汁。不同品种的葡萄汁GSH的含量差异很大，浓度范围从难以被检测到的低浓度到100 mg/L不等[13]，葡萄汁中GSH的含量也受浸渍、压榨条件以及暴露在氧气下的程度等因素的影响。浸渍或者压榨处理可以使葡萄皮中的GSH尽可能多的留在葡萄汁中[14-15]。用一些还原剂处理葡萄汁或者降低葡萄汁中溶氧水平可以获得更高的GSH含量，抑制其氧化；相反，氧化处理或提高葡萄汁中的溶氧水平则会使GSH含量降低，导致GSSG的含量明显升高[16]。

果酒中的GSH一部分来自于用来发酵的果汁，一部分则由酿酒酵母的代谢产生。果酒较低的pH在一定程度上使得谷胱甘肽多以还原型形式存在，其含量也受酿酒酵母代谢和氧的影响。一方面，GSH是酿酒酵母在发酵过程中非常重要的代谢产物之一，可利用酿酒酵母发酵生产GSH；另一方面，酿酒酵母在代谢过程中能吸收利用培养环境中的GSH，环境中GSH的含量能够影响酵母的生长代谢，不仅能维护酵母细胞的基础功能和结构的完整性，还可能涉及酵母的硫和氮代谢、解除重金属毒性和氧化应激反应等[17]。不同的菌株分泌和摄入GSH的能力差别很大，并且在酒的陈酿、贮存过程中，GSH的氧化不可避免，总有一部分被氧化为GSSG[18-19]，这些都会影响果酒中GSH的水平。

2 GSH提升果酒的抗氧化能力

在果酒的酿造过程中，酒中的化合物会参与一系列反应从而影响其感官品质。在这些反应中，最主要的就是氧化反应[20]。果酒的氧化会导致酚类化合物含量降低、风味丢失以及产生令人不愉快的气味等。为了消除或者尽可能抑制果酒酿造过程中的氧化反应，人们通常会使用一些还原性物质，如抗坏血酸、二氧化硫和GSH等[21-22]。其中，二氧化硫在果酒中的应用最广泛，而GSH的抗氧化作用则在近几年才逐渐受到关注。

当人们发现GSH可以抑制葡萄汁褐变的作用后，它逐渐被用作一种抗氧化剂添加到果酒中[23]。与GSSG相比，GSH的抗氧化性更强，这种强抗氧化性主要是半胱氨酸上的活性基团—巯基所赋有的[24]。巯基极易被氧化形成二硫键，能够表现出强的还原性。COMUZZO P等[25]对比了抗坏血酸、GSH、酒糟和酵母自溶物在白葡萄酒中的抗氧化作用，发现GSH在清除DPPH自由基方面效果显著，但是在清除氧自由基的能力上比二氧化硫要稍弱一些。FRACASSETTI D等[11]的研究也得到相似的结论，他们研究了GSH、二氧化硫和一些特定的酚类物质在澄清葡萄酒以及合成酒中的相互作用，发现在低浓度二氧化硫和GSH共同存在的情况下，两种酒体的氧消耗速率更高，证实了GSH与二氧化硫具有协同作用，并且发现了GSH能有效抑制酚类物质的氧化，有效保护了酒体的品质。HOSRY L E等[26]则证实了在白葡萄酒贮存期添加GSH，可有效抑制其氧化和老化，增强酒体的稳定性和感官品质。

3 GSH抑制果酒褐变

褐变现象是贯穿果酒整个酿造和储藏过程的化学反应，其结果是生成深色物质，影响色泽和原有的果香味，使得果酒出现氧化味，而且存放时间越长，果酒品质受到的影响越大[27]。果酒褐变的过程会涉及到部分的物质流失，还有可能影响葡萄酒的风味以及一些复杂香气的形成[28]。褐变有酶促褐变和非酶褐变两种形式，酶促褐变是在有氧条件下，多酚氧化酶催化酚类物质形成醌及其聚合物的过程，多发生在发酵前的果汁中；非酶褐变是指在没有酶参与的情况下发生的褐变，酚类化合物自身的氧化和之后的氧化聚合反应以及乙醛与酚类物质发生的聚合反应是果酒中非酶促褐变的主要途径[29]。WEBBER V等[30]在起泡酒的贮藏阶段添加了不同浓度的GSH，发现在储存到12个月时，添加20 mg/L GSH的起泡酒的颜色指数明显低于对照组，说明了GSH有抑制果酒褐变的能力。他们认为可能是GSH与羰基化合物发生反应形成了加合物，阻止了黑色物质的产生。酒中的酚类化合物氧化（主要是咖啡酸）会形成醌类化合物（反应过程如图1），醌类化合物不稳定，电子亲和力很强，相互之间很可能发生缩合反应形成暗色的聚合物。而GSH能够抑制这种缩合反应的发生，原因是GSH的巯基作为亲核中心，具有丰富的电子，能够与醌类物质结合形成一种不具有颜色且不容易被氧化的反应产物2-S-谷胱甘酰咖啡酸（2-S-glutathionyl caftaric acid，GRP）[31]，这就使得醌类化合物之间的缩合反应难以发生，可以有效的抑制酒体褐变。生成过程如图2所示。

图1 咖啡酸的氧化反应过程Fig.1 Oxidation process of caffeic acid

图2 2-S-谷胱甘酰咖啡酸的生成过程Fig.2 Generation process of 2-S-glutathionyl caffeic acid

4 GSH影响果酒风味

4.1 GSH保护果酒香气

果酒中的香气成分并非完全来自于酿酒原料，有一部分是在酒精发酵过程中形成[32]，就是平时所说的二类香气。构成果酒二类香气的物质主要有高级醇、酯、有机酸、醛类等。GSH可以通过调控酿酒酵母的代谢来影响这些香气成分的产生。有些果酒生产商就利用这一点，给酵母提供富含GSH的营养物质，以影响其代谢进而增强果酒的香气。同时，GSH具有的抗氧化能力也能有效保护这些香气成分。

高级醇酯和乙基酯能够赋予果酒水果香气，提升果酒的品质；萜烯类化合物（如芳樟醇、α-松油醇、香叶醇等）具有花香味，且香气阈值低、香味浓郁。有报道称，在起泡酒酿造过程中添加适量GSH对醇类和有机酸的含量具有显著影响，并且在发酵前的葡萄汁中添加GSH比在基础酒中添加的效果更好，其中正丙醇、异丁醇、苯乙醇、丁二酸等含量明显升高，乙醛，癸酸乙酯、辛酸、癸酸等含量下降[33]。在模型酒装瓶后的贮存期，GSH也能有效保护一些芳香化合物，如乙酸异戊酯、乙酸乙酯和芳樟醇等[34]。TOMASEVICM等[35]在白葡萄酒中添加了20mg/L的GSH，与仅添加二氧化硫的组别相比，添加GSH可以有效抑制贮藏期间酒体中芳樟醇和α-松油醇的损失，当贮藏至1年时效果更加明显。

挥发性巯基化合物，如3-巯基-1-己醇、4-巯基-4-甲基-2-戊酮、3-巯基己基乙酸酯已经被证实是葡萄酒中复杂风味的重要贡献者。WEGMANN-HERR P等[36]在酒精发酵前添加了GSH，得到了3-巯基-1-己醇含量更高的白葡萄酒，他们认为是GSH的添加影响了酿酒酵母的生长代谢，提高了酿酒酵母将无味的前体物质转化为此类香气成分的能力。TIRELLI A等[37]也证明了GSH对于此类香气物质的保护作用，他们认为GSH中含有巯基，可能与硫醇物质之间存在竞争作用，从而在一定程度上减少了硫醇化合物与邻醌的结合，保护了此类香气成分。

4.2 GSH影响异味成分的产生

GSH不仅可以保护果酒的香气成分，而且可以有效抑制果酒老化过程中异味成分的产生。2-氨基苯乙酮是果酒老化过程中的一种异味成分，在长相思葡萄酒3年的陈酿过程中，10 mg/L的GSH可有效抑制该成分的形成[38]。但是过量的GSH也会导致酒体中H2S的含量升高，产生类似于臭鸡蛋的气味[36]。一方面是因为GSH中含有的L-半胱氨酸可被半胱氨酸脱巯基酶降解形成H2S[39]；其次，过量的GSH为H2S提供了还原性的环境，一定程度上抑制了H2S的氧化。UGLIANO M等[40]认为，当长相思葡萄酒贮存到6个月时，添加高浓度GSH的酒体中的甲硫醇含量明显高于对照组，会产生令人不愉快的还原性气味。因此在果酒酿造过程中，GSH的添加量并非越多越好，根据果酒种类适量添加，才能达到增香、抑制异味产生的目的。

5 GSH促进苹果酸乳酸发酵

苹果酸-乳酸发酵是葡萄酒、苹果酒等果酒酿造中非常重要的生物降酸过程。酒酒球菌是苹果酸-乳酸发酵的主要启动者，它能够参与葡萄糖代谢、有机酸代谢，以及发酵过程中一些相关产物的形成和流向，对葡萄酒苹果酸-乳酸发酵有重要作用，同时也决定着果酒的最终品质[41]。GSH对苹果酸-乳酸发酵的促进作用主要体现在其对酒酒球菌生长代谢的影响上。酒酒球菌（Oenococcus oeni）中并没有合成或分解GSH的基因，因此它并不能合成GSH，但是可以摄取培养基中的GSH[42]。MARGALEF-CATALA M等[43]选择了3种具有GSH摄入能力的酒酒球菌作为研究对象，在高含量乙醇以及低pH的胁迫条件下培养后发现：培养基中添加了GSH的酒酒球菌生物量明显多于对照，且细胞膜中环丙烷的含量升高，细胞膜流动性与经历酒精、氧化胁迫后的恢复性也明显高于对照组，说明GSH能够提高酒酒球菌在胁迫条件下的适应性，促进其生长代谢，进而加速苹果酸-乳酸发酵的进程。但是对于GSH促进酒酒球菌生长代谢的作用机制以及添加GSH对苹果酸-乳酸发酵的直接影响鲜见报道，需要进一步的研究。

6 富集谷胱甘肽非活性干酵母制剂的应用

商业非活性干酵母制剂（inactive dry yeast，IDY）可由在高浓度的糖和有氧条件下培养的酿酒酵母经高温灭活后制得。IDY大致可分为酵母自溶物、酵母细胞壁、酵母抽提物和非活性酵母4种[44]。因为IDY具有非常多的潜在功能，学者们对于它在酿酒过程中的应用也愈发感兴趣。

富集谷胱甘肽非活性干酵母制剂（glutathione-enriched inactive dry yeast，g-IDY）是IDY的一种，在酒精发酵期间，它可以通过直接释放GSH或提供GSH合成的前体物质以增加酒体中GSH的含量[45]。g-IDY对葡萄酒的酒精发酵以及感官品质的影响也是当前的研究热点。RODRIGUEZBENCOMO J J等[46]在加速氧化的条件下，研究了g-IDY对模型酒香气物质的影响，他们发现g-IDY确实在模型酒中释放了GSH，提高了模型酒中GSH的含量并有效抑制了萜烯类化合物的损失。也有学者发现g-IDY中的酵母组分可影响果酒感官品质。如其中的酵母甘露糖蛋白可以和单宁、花青素相互作用，减少了多酚的聚集和沉淀，能在一定程度上保护果酒色泽[47]。此外，g-IDY在制备过程中由于热效应会形成含氮杂环挥发性化合物，这些物质在酒中会释放出来，从而丰富了果酒香气[48]。因此g-IDY可作酒精发酵和苹果酸乳酸发酵的“增强剂”，提高酵母以及乳酸菌在胁迫环境下的抵抗力，改善含氮化合物的同化吸收以及提升酒的品质特性。

7 结语

在果酒酿造过程中，氧化褐变、风味损失以及二氧化硫残留等是亟待解决的难题。而GSH作为一种活性三肽，在解决此类问题上效果明显、前景广阔。第38届世界葡萄与葡萄酒大会允许一定量的GSH处理葡萄汁和葡萄酒，为果酒酿造提供了科学的理论指导。国内外的研究多见于GSH对葡萄酒酒精发酵阶段及贮藏阶段的影响，需要开展更多的研究来评价GSH对其他果酒以及苹果酸乳酸发酵阶段品质特性的影响。此外，GSH与二氧化硫之间存在着协同作用，如何通过添加GSH来减少二氧化硫的使用量也是一个值得深入研究的问题。