蔬菜幼苗叶面积快速测定方法筛选与优化

潘铜华 王云龙 杨俊伟 习林杰 丁娟娟 张 静邹志荣

（西北农林科技大学园艺学院，农业部西北设施园艺工程重点实验室，陕西杨凌 712100）

叶片是植物进行光合作用及蒸腾作用的重要场所（曹仪植和宋占午，1998；乔宝营 等，2004；赵滢 等，2012），叶面积大小是表征叶片光合能力、蒸腾能力、逆境胁迫程度、植株生长状态以及预测植株生产力的重要指标（Steinger et al.，2003；田青 等，2008）。叶面积大小的精准快速测定，对于指导栽培管理、实现水肥管理优化、高产高效具有重要意义（陈卓 等，2010；盛双 等，2011）。目前，测定叶面积的方法有很多种，如方格法、剪纸称重法、公式回归法、叶面积仪法、光电法、数值图像处理法、打孔称重法等（王颖 等，2016）。不同的方法各有利弊，需进行综合评判（高建昌 等，2011；崔世钢和秦建华，2017）。相比较而言，方格法具有工作量大、耗时长的缺点，但是结果较接近真实值，常用于对其他测定方法所得结果进行校正（柳觐 等，2014；李乐 等，2016）。剪纸称重法测得结果受叶片形状及人为因素的影响较大，同时受纸片均匀度影响（崔世钢和秦建华，2017）。打孔称重法操作比较简单，省时省力，但是结果重复性较差，且误差较大（王留梅 等，2001）。叶面积仪法操作简单，但因其扫描方向与速度等受人为因素影响很大，难以实现匀速，误差较大（孙岚和马德伟，1985）。光电法、数字图像处理法等操作较简单，但对操作技术要求较高，对于叶缘不规则的叶片难以捕捉其形状；同时，测定结果受拍照角度、叶片大小、叶片形状等多因素以及拍照技术、AutoCAD、Matlab、PS操作技术等的影响，且这些软件操作对于较多叶片的测定比较费时（肖强 等，2005；田青 等，2008；张万红 等，2017）。随着科技的不断发展、仪器设备的不断改进，采用高端仪器快速准确测定叶面积是今后的一种发展趋势（刘关君 等，2004；孙雪文 等，2005）。

本试验采用EPSON平台扫描仪结合WinRHIZO根系分析系统测定番茄幼苗叶面积，比较其与常规叶面积测定法（方格法、打孔称重法、叶面积仪法）测定结果的准确性、精确性与测定速度，并用不同材料进行验证，最后对筛选出的最佳方法进行优化。旨在得到一种准确、精度高且快捷的蔬菜幼苗叶面积测定方法，为植物生理生态研究及栽培管理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年3～4月在西北农林科技大学北校园艺场及人工气候室内进行。供试材料为金棚1号番茄、早春2号黄瓜和碧螺6号辣椒，由杨凌裕丰农业科技有限公司提供。蔬菜幼苗种植于西北农林科技大学北校园艺场日光温室中，在四叶一心时取样进行不同方法叶面积测定与综合评价。

1.2 主要仪器设备

爱普生扫描仪及WinRHIZO根系分析系统（EPSON Perfection V700 Photo，Canada regent，Canada）、AM200叶 面 积 测 定 仪（AM200，ADC BioScientific Ltd.，Hoddesdon，England）、HYZ-71计算纸（HYZ-712，上海顶峰绘图纸厂）、千分之一天平（JD100-3，沈阳龙腾电子有限公司）。

1.3 试验方法

分别剪取四叶一心的番茄、黄瓜及辣椒叶片若干片放在托盘中，盖上湿润的纱布，防止叶片萎蔫收缩。依次采取方格法、叶面积仪法、扫描分析法及打孔称重法对随机选取的4片番茄叶片进行叶面积测定，每个方法重复测定5次，计算平均值及标准误。同时记录5次测定的总时间，比较4种方法测定叶面积的用时长短。为尽量减少外界环境对试验结果造成的影响，在测定过程中，通过空调、加湿器控制，使室内温度控制在20℃左右，空气湿度控制在60%～70%。

方格法：测定前用吸水纸吸干叶片表面水分，将叶片正面朝下平铺于25 cm×35 cm大小的计算纸上，然后用三角板压住一半，用铅笔小心绘制另一半的边缘轮廓，绘制完毕后，用手固定，并用三角板压住，绘制另一半的边缘轮廓。每两次测定间隙用湿毛巾擦拭叶片保持叶片湿润，绘制完立即用湿毛巾覆盖，以防叶片萎蔫。所有叶片统一进行绘制。

叶面积仪法：采用ADC公司生产的AM200型便携式平板叶面积仪，将叶片正面朝上，夹在平板叶面积仪的扫描区及透明压板之间，通过调节扫描器左边的黑色旋钮，使测得叶片长度尽量接近叶片实际长度，按住“start”，匀速缓慢扫描叶片，当整个叶片扫描完毕，再按一次“start”停止扫描，得出叶面积。

扫描分析法：首先将叶片正面朝上平铺于扫描区域，选择扫描像素为200 dpi（高建昌 等，2011）；然后选择“preview”预扫描叶片，用适宜大小的虚线框框住预扫描图，选择“scan”进行扫描，扫描结果以JEPG图片格式保存。最后，插入根系分析仪电子狗，双击WinRHZIO软件，打开扫描图片，用虚线框框住图片，单击“OK”，得出测定结果，建立一个text文件保存结果。

打孔称重法：采用直径1 cm的打孔器获得8个小圆片，称取单个小圆片的质量，然后通过整片叶片的质量与单个小圆片的平均质量相比，换算出叶片的叶面积。

方法验证与优化：采用方格法和扫描分析法对黄瓜叶片、辣椒叶片及已知面积的长方形纸片进行测定，试验设5次重复，验证扫描分析法测定结果的准确性。对扫描分析法的不同分辨率（50、96、150、200、300、400、600、800、1 200 dpi） 下 黄瓜叶面积的单次测定结果进行比较分析，并对准确性、精确性、所需时间等进行综合比较，筛选最佳扫描分辨率。

1.4 数据处理

采用Excel 2007和DPS 7.05统计分析软件进行数据处理、方差分析与显著性检验（Duncan新复极差法），采用Excel 2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同测定方法的准确性与精确性比较

由图1可知，与方格法相比，叶面积仪法测定的数据显著偏低（平均降低12%～16%），而打孔称重法测定值则显著升高（平均升高4.2%～12.9%）。采用扫描分析法，除了2号叶的测定值显著低于方格法以外，其余叶片测定值与方格法无显著差异。通过分析测得的标准误可知，打孔称重法测得值与平均值之间偏离程度最大，叶面积仪法次之，而方格法与扫描分析法测定结果偏离平均值程度较小，说明扫描分析法和方格法的精度高，结果可重现性更好。同时，相比叶面积仪法和打孔称重法，扫描分析法测定值更接近真实值，可以用于准确测定叶面积。

2.2 不同测定方法的用时比较

不同叶面积测定方法5次测定所需时间差异显著（图2）。方格法所需时间最长（5 205 s），叶面积仪法次之（690 s），而扫描分析法（498 s）和打孔称重法（468 s）用时最少。综合比较测定结果准确性（图1）和所需时间（图2），扫描分析法是一种快速、准确且精度高的幼苗叶面积测定方法。

2.3 叶面积测定方法验证

2.3.1 黄瓜与辣椒叶片验证 由图3可知，采用扫描分析法，黄瓜和辣椒叶片叶面积测定值均显著低于方格法，分别降低了2.59%和5.56%。扫描分析法的标准误低于方格法，说明扫描分析法测得的数据精度更高，结果比较可靠。

图1 不同叶面积测定方法对番茄叶片的测定结果比较

图2 不同叶面积测定方法5次测定用时比较

图3 蔬菜幼苗叶面积扫描分析法测定结果验证

2.3.2 使用已知面积纸片验证 用信封随机剪取10个不同面积的长方形纸片，用直尺准确测定长和宽并计算面积，再用扫描分析法进行测定。由表1可知，扫描分析法测定结果与直尺测定值之间的误差为-2.14%～3.02%，处于±5%之间，数据可靠，说明扫描分析法的测定结果接近真实值，可用于准确、快速测定叶面积。

2.4 扫描分析法中不同dpi设置的测定时间及测定结果比较

本试验结果表明，扫描分析法可以快速、准确测定番茄、黄瓜及辣椒叶片的叶面积。以上结果是在扫描分辨率为200 dpi的条件下所得（高建昌 等，2011）。扫描分辨率是决定扫描仪获得像素数量的重要因素，分辨率的高低可能对测定面积存在影响（李宝光 等，2006；高建昌 等，2011）。不同扫描分辨率条件下，扫描时间、扫描结果可能不同。由图4-A可知，扫描分辨率越高，扫描及分析所需时间越长，其中dpi为50与96时所需时间最短，分别为40.9 s和44.5 s，二者无显著差异，而96 dpi下测得的变异系数更大，50 dpi下的测定时间比较稳定。150 dpi与200 dpi的所需时间显著高于前两者。由图4-B可知，不同扫描分辨率下测定结果无显著差异。因此，扫描分析法中50 dpi的扫描分辨率即可快速、准确测定叶面积。

表1 基于不同面积纸片的扫描分析法测定结果验证

图 4 不同扫描分辨率下单次测定所需时间（A）及单个叶片测定结果（B）比较

3 讨论

蔬菜幼苗叶面积大小是表征植株长势强弱的一项重要指标（王颖 等，2016）。通常情况下，由于幼苗叶片较软较薄，且叶面不平，准确快速测定叶面积难以实现。方格法作为一种经典的叶面积测定方法，测定结果比较接近真实值，常用于对其他测定方法的结果进行验证（柳觐 等，2014；李乐 等，2016）。因此，本试验选用方格法作为参考，比较几种方法与方格法测定值间的差距。叶面积仪法（宋卫堂 等，2017；王京伟 等，2017）、打孔称重法（朱艳 等，2017）是目前测定幼苗叶面积较为常用的方法。本试验比较了叶面积仪法、扫描分析法和打孔称重法测定叶面积的准确性与精确性，并比较了这些方法的操作简便性，可为选择适宜的叶面积测定方法提供参考。

本试验发现，采用叶面积仪法测定的结果显著低于方格法，可能是由于幼苗叶面积较小，导致操作平板叶面积仪时难以做到匀速，叶片难以完全扫描的缘故（孙岚和马德伟，1985）。而打孔称重法测定的叶面积显著高于方格法，可能是由于幼苗叶脉的密度显著高于叶肉密度，且越靠近叶脉，叶片厚度增加，密度增大，使得小圆片的密度小于平均叶密度。本试验还发现，叶面积仪法测定时间显著高于扫描分析法，是因为叶面积仪法测定叶面积时受主观因素影响更大，需要不断调整明暗程度及手推速度以使测得叶长尽量接近实际叶长。本试验以黄瓜和辣椒叶片为例，验证扫描分析法的可靠度。结果发现，测得的辣椒叶片叶面积比方格法降低了5.56%，可能是由于辣椒叶片叶面积明显小于黄瓜（前者叶面积约为后者的19.05%），导致同样或较小的绝对误差引起了更大的相对误差。由于采用方格法测定叶面积也很难测得真实值，而纸片形状规则、不易变形的特点更利于真实值的测定，因此，本试验进行了基于不同面积纸片的扫描分析法结果验证。测得结果与真实值间的误差小于黄瓜或辣椒叶面积验证过程的误差，可能是由于方格法测定过程中下压叶片的幅度远大于扫描时幅度，导致方格法测得结果大于自然状态下叶片叶面积，从而使黄瓜和辣椒验证得到的误差绝对值高于理论值，这也从另一方面说明了扫描分析法结果的准确性。

在结果可靠的基础上，测定用时也是评价测定方法优劣的一个重要指标。本试验发现，不同扫描分辨率下的测定结果无显著性差异。随着扫描分辨率的增加，所用时间逐渐增加，这可能是由于较大的扫描分辨率使扫描图片所占磁盘空间更大，导致电脑运行速度减慢，与前人的研究结果一致（李宝光 等，2006），说明扫描分辨率设定越小越有利于快速准确测定叶面积。

目前，测定植株叶面积的方法有多种（王颖等，2016）。受试验样品（如叶片大小、叶片是否规则、是否野外操作等）（苑克俊和孙瑞红 1994）、设备条件（设备价格、手持灵活性等）（宋英博 等，2015）、试验目的（高精度测定或粗略估计、是否破坏性取样）（肖强 等，2005）等的影响，所选用的叶面积测定方法不尽一致（柏军华 等，2005）。因此需要根据试验目的及试验设备的易得性，选取合适的叶面积测定方法。通常，对于面积比较大的叶片以及只需快速粗略测定叶片面积时，建议采取打孔称重法（乌兰 等，2015）。对于设备比较简陋或是缺乏高端设备（如叶面积仪、高端数码仪器）、样品面积较小且对结果要求比较精确时，可采取公式回归法（王颖 等，2016）。对于叶面积很小且要求快速测定、对试验结果要求不太精确时，可采用叶面积仪法（Qian et al.，2012；Zhang et al.，2015）。对于条件充足且对测定结果要求非常精确的科研工作者，可选用高端仪器设备（如数码相机、扫描仪）与先进的数据分析软件（如ImageJ、PS、CAD、Matlab、根系分析仪等）进行快速且精确的蔬菜叶面积测定（高建昌 等，2011；于守超 等，2012；赵滢 等，2012；Shu et al.，2014；张万红 等，2017）。方格法作为一种最经典、最准确的叶面积测定方法，由于其操作的繁琐性，通常只用于标定其他方法的准确性，而不建议用于实际的叶面积测定。

4 结论

不同叶面积测定方法所需时间、测得结果的准确性和精度均存在差异。相比方格法、叶面积仪法和打孔称重法，扫描分析法兼具准确性高、精度高且用时短的优点。扫描分析法不同扫描分辨率下测定的叶面积无显著差异，且选择更低扫描分辨率测定所需时间更少，结果可靠。采用50 dpi扫描分辨率测定蔬菜幼苗叶面积，结果可靠、精度高、用时最少，可作为测定蔬菜幼苗叶面积的首选方法。