花露水及其混合物对蛋白核小球藻的毒研究

卞志强，丁婷婷，张 瑾,2，董欣琪

(1.安徽建筑大学环境与能源工程学院，安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室，合肥 230601；2.清华大学新兴有机污染物控制北京市重点实验室，北京 100084）

0 引言

花露油为花露水的主题香料，以酒精为辅制成香水类产品，作为夏天常用物品，清热解毒、驱蚊杀菌止痒、无副作用、不刺激皮肤、滋润皮肤的功效[1]。但是媒体报道花露水中含有农药成分，可是专家检测发现花露水中只是含有极其少量的农药成分，媒体与专家说法存在差异，经过查阅资料分析了花露水中有香精、蛇胆提取液、人工合成牛黄等成分，香精具有很好的稳定性和持久性，但大量的使用也会对婴儿的神经系统和造血系统造成破坏，香精的安全性依赖于其中所含香料和辅料是否符合安全性要求，所以，调香工作者在为某加香成品设计香精配方时，就要根据该加香成品的使用要求来选用包括持久性、稳定性和安全性在内的合适的香料和辅料，三者不可偏废。这样才能控制毒性的扩大。所以探索花露水毒性效应彰显重要意义。

Zhu等[2]采用的浓度-时间-效应曲面(C T ES)研究得知毒性随时间的延长而增加，不同种类的毒性物质，它们的毒性增加幅度存在不同。所以毒性检测要重视时间点对暴露生物的效应和暴露生物随时间变化的动态效应[3]。只有这样以后的研究才能更加深入的了解污染物毒理的作用机制、作用途径和污染物毒理。

所以用3种花露水六神花露水、蛇胆花露水、金银花花露水作为研究对象，研究3种花露水及其混合物对绿藻蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的时间毒性。再根据3种花露水在不同暴露时间的毒性的实验结果做为花露水在其它方面毒性分析作为参考依据，以便解决相关的毒性问题，为环境的改善作出贡献。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：3种不同品牌的花露水，六神、蛇胆和金银花，购自超市。花露水本身就是一个含各种成分的混合物[4]。

仪器包括：Synergy 2 Multi-Mode微板光度计（美国Bio Tek伯腾仪器有限公司）、超净工作台（三发仪器有限公司）、FA1004型五位电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）、YX280A手提式压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）、SC-242型透明门立式冷藏柜（青岛海尔电冰柜有限公司）、B S-2E 数显振荡培养箱（上海梅香仪器有限公司）、D H G-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）和D r a g o n-l a b单道可调移液器(10-100μL)(大龙兴创实验仪器有限公司)。

1.2 藻种培养

蛋白核小球藻(C.p y r e n o i d osa)购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FA C HB)，其培养基采用SE培养基，培养基的配制和藻培养过程参见文献[6]。

1.3 混合物设计

将本实验体积比法设计了3种花露水两两之间的混合物体系3个，每个混合物体系设计了1：1、1：2、1：3、2：1和3：1不同体积比的5个混合物，然后结合固定射线法，将个混合物扩展成体积比相同的射线，即5条混合物射线，共15个混合物射线。

1.4 微孔板设计与毒性测试

花露水的易挥发性会导致实验造成很大无误差，因此，研究中的微孔板在过去设计方案的基础上，参考了陈琼等[3]实验改进方法。

1.5 时间毒性计算与数据处理

计算公示参见文献[2]。数据处理采用Weibull(1)和Logit(2)两种非线性函数进行拟合：

式中α、β－Weibull和Logit的位置与斜率参数

E－效应即污染物对绿藻Cpyrenoidosa的生长抑制率[5]

c－浓度(表示为花露水在实验中实际被稀释倍数的倒数)

2 结果与分析

2.1 单个物质浓度-效应曲线(CRC)

非线性函数能较好拟合3种花露水对绿藻在不同时间的浓度-毒性数据，不同时间节点的拟合CRC s见图1。图1可看出：藻受3种花露水单独作用的毒性都清楚表现出时间依赖性，JYH、LS和SD在0～12 h内均无明显的毒性，JYH在24h内仍无明显毒性，等到24 h之后所受到毒性开始迅速增加，直到45 h达到最大值，之后毒性开始下降到72 h趋于稳定；L S在48 h内无明显毒性，直到48 h后才开始迅速增加，增加到72 h后毒性达到最大值；SD在12 h后毒性就开始迅速增加，30 h时达到最大值，然后开始下降直到72 h毒性增长速度趋于平缓。

图2是3种花露水的不同毒性指标值随时间变化曲线。从图2可看出：三种物质的毒性同样具有时间依赖性，但物质种类不同导致时间毒性变化规律也不相同：J Y H和SD的p EC20和p EC30值是随时间延长先增强后有下降趋势，p EC40和p EC50值随时间延长逐渐增加；L S的p EC20、p EC30和p EC40随时间逐渐增加，最大毒性上未超过50%的效应p EC50值一直是0；对于同一暴露时间，3个物质的同一毒性指标随时间也是变化的，但在72 h和96 h，L S的p EC20、p EC30和p EC40值明显大于J Y H和SD的p EC20、p EC30和p EC40值p EC20、p EC30和p EC40值明显大于J Y H和SD 的p EC20、p EC30和p EC40值。

图1 3种花露水在6个时间节点的浓度-效应曲线(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

图2 3种花露水毒性随浓度的变化曲线(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

2.2 混合物浓度-效应曲线CRC

时间毒性微板分析法测得花露水混合物（金银花、蛇胆）在不同时间节点下浓度-效应数据以及使用非线性最小二乘拟合方法得到的C R C s，见图3。为了能够比较不同体积比的两元花露水混合物在同一时间节点的毒性大小，四个毒性指标值p EC20、p EC30、p EC40和p EC50随时间的变化见图4。

从图3可以看出：金银花和蛇胆的混合物变化规律[5]基本与单一花露水的变化规律相同，可是不同体积比的混合物毒性大小是和两种组分在混合物中所占比例存在很大的关系，即为浓度较高的物质对混合物的毒性大小起着主导作用。

图3中得出：暴露时间为48 h毒性大小顺序为：2:1＞1:2＞1:3＞3:1＞1:1；72h：2:1＞1:2＞1:3＞3:1＞1:1；96 h：1:1＞3:1＞2:1＞1:3＞1:2；96 h：1:2＞1:3＞2:1＞3:1＞1:1。可以得知5种不同体积比的混合物毒性均是随着暴露时间的延长而增加，明确的表现出时间依赖性。

图3 6个时间节点的JS混合物的浓度-效应曲线(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

图4 3种花露水的毒性随时间的变化曲线(■0h；●12h；▲24h；○48h；◇72h；★96h)

图4 可看出混合物的毒性均从24 h以后开始急剧增加，72 h时开始趋于平缓且不再变化，可能由于随着培养时间的增加花露水中有较多的成分挥发使得毒性减弱，但可以看出随时间混合物毒性都在增加，包括金银花与六神以及六神与蛇胆的混合物均符合规律，都表现明显时间依赖性。

上述结果表明：护肤品花露水的毒性会随着物质存在的时间的变化而变化，极大对人体或环境造成影响，所以研究生活中花露水的毒性变化规律，掌握花露水最大无作用量以及最小有作用量指标非常重要，对我们正确使用花露水减少对人体以及环境的伤害有着非常重要的意义。

3 结论

3种花露水以及花露水混合物对小球藻毒性随时间变化而逐渐变化的规律，实验测定随时间变化花露水的毒性先急剧增大，再趋于平稳，不同暴露时间点的毒性大小也各不相同，以花露水单一物质为例，以半数效应浓度(EC50)的负对数p EC50为毒性指标，暴露时间48 h时毒性大小顺序为：六神＞蛇胆＞金银花;暴露时间为72 h时：蛇胆＞金银花＞六神;暴露时间为96 h时毒性大小顺序为：蛇胆＞金银花＞六神；花露水各浓度比混合物毒性变化规律与单一花露水变化规律基本相同，经历先不变再急剧增加最后不变三个过程。花露水的毒性会随着时间的增加而增加，这就可以通过依靠时间来控制其毒性的污染。花露水及其混合物对蛋白核小球藻的毒性不仅仅与时间有关，还与浓度、受试物的敏感性、气象条件等有关。所以这都对我们研究环境污染有着巨大的挑战，同时也能够更好的为环境的治理提供机会。