桑椹果酒主发酵过程中主要理化指标的变化

张 晶,左 勇,*,谢光杰,黄丹丹,孙时光,张 鑫,秦世蓉,何颂捷

(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.四川化工职业技术学院,四川泸州 646000;3.川北医学院基础医学院,四川南充 637000)

桑椹果酒是以新鲜桑椹为原料,接种酵母发酵而成的低度饮料酒,营养丰富,具有保健功效[1-2]。桑椹果酒主发酵过程中,随着糖逐渐被消耗,醇类、酯类、酸类等各种物质大量生成,且各物质相互补充,赋予桑椹果酒独特的风味特征,对果酒的口感和品质有着重要影响[3]。

针对桑椹果酒发酵过程中主要物质的变化情况,科研人员进行了相关研究,其中,王艳辉等[4]研究了不同温度条件下桑椹果酒发酵过程中酒精的生成规律,确定了桑椹干红最适发酵温度。Wang等[5]考察了品种、温度和环境对桑椹果酒中褪黑激素的影响。黄晓杰等[6]对桑椹果酒不同发酵阶段抗氧化活性进行研究,发现缩短发酵时间有利于酚类物质的保留,会提高酒液的抗氧化能力。赵红宇等[7]以桑椹干果为原料,考察了桑椹果酒全渣发酵过程中生物活性物质及其抗氧化活性的变化情况。可以看出,目前对桑椹果酒的研究主要是针对某种桑椹的某种特定成分,而对反应桑椹果酒发酵进程的主要理化指标的综合性研究相对欠缺。在生产过程中,若不对桑椹果酒发酵过程进行实时监控,就不能对发酵条件进行针对性的控制,不利于果酒品质的保障。

因此,本实验拟通过对桑椹果酒不同发酵阶段主要理化指标的分析,初步揭示桑椹果酒主发酵过程中主要物质的变化规律,从而为桑椹果酒发酵过程的控制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑椹 四川某农场;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;甲醇、有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸) 色谱纯,天津市光复精细化工研究所;氢氧化钠、重铬酸钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、磷酸二氢钠、无水乙醇、硫酸、磷酸等 均为分析纯。

GZ-250-HS11型恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有限公司;YXQ-LS-75S11型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LB20T型手持糖度计 成都格纳丝商贸有限公司;BT125D型分析天平 上海精密科学仪器有限公司;HH-S型恒温水浴锅 江苏省金坛市正基仪器有限公司;T6型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;TW-2000W型可调温电炉 成都市永兴电器厂;STARTER 2C型pH计 奥豪斯仪器(上海)有限公司;78-1型磁力加热搅拌器 常州一诺仪器制造有限公司;TGL-16G型台式离心机 上海安亭科学仪器厂;Agilent 1200型高效液相色谱 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑椹果酒制备工艺及操作要点

1.2.1.1 工艺流程 桑椹果实→破碎打浆→成分调整(添加白砂糖、调酸)→主发酵→分离→后发酵→初滤→调整→陈酿→澄清→精滤→装瓶→杀菌[8]。

1.2.1.2 操作要点 将桑椹置于室温解冻,破碎打浆得桑椹汁,向桑椹果醪中添加一定量的白砂糖以调整果醪糖度为150 g/L,并按1 g/L的量加入柠檬酸以调节发酵醪酸度;按5%的比例接入酵母种子液(称取2 g安琪活性干酵母于20倍质量的5%糖水中,于26～30 ℃活化60 min,将活化的酵母液接入发酵醪)于桑椹果醪中,将发酵醪置于26 ℃下发酵7 d,发酵过程中进行搅拌以便完全发酵;发酵结束时进行倒罐,并根据果醪糖度和酒精度,补加白砂糖,封罐进入后发酵,发酵8～10 d至残糖含量小于4 g/L;经后发酵的桑椹果酒密封陈酿3～6个月;陈酿结束后,将桑椹果酒经板框过滤机过滤、装瓶并进行巴氏灭菌。

1.2.1.3 取样 将酵母接入发酵醪的时间计作发酵第0 d,桑椹果酒主发酵通常为7 d左右,从而设置样品采集时间分别为0、1、2、3、4、5、6、7 d。

1.2.2 理化指标的测定 pH:采用pH计直接测定;总酸、挥发酸、总糖、干浸出物:参照GB-T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法进行测定[9];酒精度:参照张建夫等[10]、魏晓霞[11]测酒精度的方法,并做相关修改,具体步骤为:先向比色管中加入5 mL 5%重铬酸钾溶液(5 g重铬酸钾和10 mL硫酸定容至100 mL),再分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 5%乙醇溶液,加蒸馏水定容至25 mL,置于85～90 ℃水浴锅20 min,冷却至常温,测吸光值(600 nm),并绘制标准曲线。取50 mL桑椹发酵液,加入50 mL水进行蒸馏,至馏出液为50 mL左右,加水定容至100 mL,再取0.5 mL蒸馏液至装有5 mL 5%重铬酸钾溶液的比色管中,并加蒸馏水定容至25 mL,测吸光值(600 nm),最后通过标准曲线计算酒精含量。

1.2.3 感官评定 感官评定小组由7名酿酒专业教师和学生组成,参照潘训海等[12]桑椹果酒感官评定标准,对不同发酵阶段桑椹果酒的色泽、香味、滋味、典型性4个方面进行感官评定,具体标准见表1。

表1 桑椹果酒感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria for mulberry wine

1.2.4 有机酸的测定

1.2.4.1 色谱条件及标准曲线绘制 色谱柱:Gemini 5u C18110A(250 mm×4.6 mm,5micron);流速:0.7 mL/min;柱温:35 ℃;进样体积10 μL;检测波长:210 nm;流动相:5%色谱甲醇-95%磷酸二氢钠(0.02 mol/L)。分别配制有机酸单种标准溶液和混合标准溶液,并对混合标准溶液进行梯度稀释,依次配制成0.5、0.25、0.125、0.0625倍的有机酸混合标准溶液。以有机酸标准品进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得到标准曲线[13]。根据保留时间对有机酸定性,以有机酸对应的峰面积作为纵坐标代入标准工作曲线定量分析样品中有机酸浓度。

1.2.4.2 样品的测定 取1.5 mL桑椹果汁和不同阶段桑椹发酵液,10000 r/min离心10 min,以除去菌体和杂质,所得上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤得待测样品[14],随后进行液相色谱测定[15]。

1.3 数据处理

实验数据经SPSS 19.0软件分析,在0.05水平上对实验结果进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 桑椹果酒发酵过程中pH与总酸的变化情况

pH和总酸对桑椹果酒的发酵有着重要影响,pH通过影响酵母菌体内酶系组成和活性以调节代谢产物[16];总酸不但影响微生物的代谢活动,而且还会对桑椹果酒的颜色、口感和风味造成影响[17]。其变化情况如图1所示。

图1 桑椹果酒主发酵过程中pH和总酸的变化Fig.1 Changes of the pH and total acid in mulberry wine during main fermentation process注:不同小写字母表示总酸含量差异显著(p<0.05);不同大写字母表示pH差异显著(p<0.05)。

由图1可知,在桑椹果酒主发酵过程中,发酵醪pH总体上呈先下降后上升的趋势,总酸反之。发酵0～1 d,pH快速下降,从4.32下降至4.06;与此相对应的是,总酸由3.31 g/L上升至6.64 g/L。导致总酸急剧上升的原因主要是酵母发酵产酸。发酵初期(第0～1 d),由于酵母迅速繁殖、代谢,发酵醪中的糖类物质被代谢成醇类、酸类等物质,使总酸升高,pH降低[18]。至发酵第2 d,桑椹果醪总酸迅速下降,此后总酸含量持续降低,到发酵第6～7 d,总酸变化趋于平缓(p>0.05),与此同时,桑椹醪液pH逐渐上升,直到发酵第7 d,pH不再显著变化(p>0.05)。其原因可能是部分酸类物质在发酵过程中作为中间代谢产物转化为其他物质,如酸和醇脱羧形成酯类物质,也可能是酸类物质的积累在一定程度上抑制了酵母产酸,造成总酸含量降低[19]。

2.2 桑椹果酒发酵过程中挥发酸的变化情况

挥发酸是酵母不完全发酵形成的副产物,适量的挥发酸赋予桑椹果酒愉悦的香气,但挥发酸含量过高,将给人带来尖酸感和不愉快的醋味,被认为是一种损害性物质,会影响桑椹果酒的口感和品质[20]。其变化情况如图2所示。

图2 桑椹果酒主发酵过程中挥发酸的变化Fig.2 Changes of volatile acidity in mulberry wine during main fermentation process注:不同大写字母表示挥发酸含量差异显著(p<0.05)。

由图2可知,在桑椹果酒发酵过程中,挥发酸呈先上升后趋于平稳的趋势。发酵0～1 d,桑椹果酒挥发酸含量快速上升,从0.11 g/L上升至0.45 g/L,发酵2～6 d,挥发酸含量仍呈逐渐上升的趋势,但上升速度变缓,到发酵第7 d时,挥发酸含量趋于平稳(p>0.05)。在发酵初期(0～1 d),引起挥发酸升高的原因可能是随着酵母的代谢,包括醋酸在内的各种酸类物质大量生成,而在桑椹果酒发酵中(2～6 d)、后期(7 d),挥发酸增长速度减慢,这主要是由于随着发酵的进行,发酵醪中营养物质不断被消耗,pH和总酸发生相应的变化,导致酵母活力降低,酵母正常代谢活动受到抑制,开始利用柠檬酸等作为底物代谢形成挥发酸等发酵副产物[21]。

2.3 桑椹果酒发酵过程中总糖与酒精度的变化情况

总糖和酒精度是考察桑椹果酒发酵是否正常进行的重要指标,在桑椹果酒主发酵过程中,总糖和酒精度含量的变化不仅反映糖的利用和酒精的产生情况,同时也反应发酵醪的发酵程度[22]。其变化情况如图3所示。

图3 桑椹果酒主发酵过程中总糖和酒精度的变化Fig.3 Changes of residual sugar and alcohol content in mulberry wine during main fermentation process注:不同小写字母表示酒精含量差异显著(p<0.05);不同大写字母表示总糖差异显著(p<0.05)。

由图3可知,桑椹果酒发酵前2 d,发酵醪总糖含量急剧下降,从149.46 g/L下降至10.04 g/L,从发酵第2 d起,总糖含量仍缓慢降低并逐渐趋于平稳(p>0.05);与总糖相对应的是,桑椹果酒发酵前2 d,发酵醪酒精度急剧上升,从0%vol升高至7.45%vol,到发酵第3 d时,酒精度达到最高的7.63%vol,此后,发酵醪酒精度呈缓慢降低的趋势,到发酵结束时为7.22%vol(p>0.05)。造成以上变化的原因主要是在桑椹果酒发酵初期(0～2 d)酵母代谢活动旺盛,糖类物质被大量用于酵母的生长繁殖和酒精发酵,从而导致发酵醪中总糖含量急剧降低,反之酒精含量迅速上升,随着发酵进入中后期(2～7 d),酵母能利用的糖类物质减少,同时酒精的积累也会使酵母发酵性能受到一定程度的抑制,这些都是导致糖降解速率降低的原因[23],发酵过程中,由于部分醇类物质参与到酯类物质的合成,使酒精度呈现略微降低的趋势。

2.4 桑椹果酒发酵过程中干浸出物的变化情况

干浸出物含量与桑椹原料及桑椹果酒生产工艺有着密切的关系,是评价桑椹果酒质量的一项重要指标。通过对桑椹果酒发酵过程中干浸出物含量的测定,可确定桑椹果酒是否掺假[24]。其变化情况如图4所示。

图4 桑椹果酒主发酵过程中干浸出物的变化Fig.4 Changes of dry extract in mulberry wine during main fermentation process注:不同大写字母表示挥发酸含量差异显著(p<0.05)。

由图4可知,桑椹果酒发酵前2 d,干浸出物含量迅速上升,随着发酵进入中后期(2～7 d),干浸出物增长趋势减缓,直至发酵结束不再显著变化(p>0.05)。造成干浸出物变化的原因主要是发酵前期桑椹发酵醪中营养丰富,酵母发酵性能良好,大量糖类物质被迅速代谢,使干浸出物含量快速上升,当发酵进入中后期,由于糖类物质减少,转化为干浸出物的量也随之减少[25]。

2.5 桑椹果酒发酵过程中有机酸的变化情况

有机酸是桑椹果实和果酒的重要组成部分,在果实的成熟阶段、果酒的加工及陈酿阶段都会引起有机酸组成和含量的变化。通过采用高效液相色谱法对桑椹果汁和不同阶段桑椹发酵醪中草酸、酒石酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸进行测定,得到各种有机酸含量见表2。

表2 桑椹果酒发酵主过程中有机酸的变化Table 2 Changes of organic acid in mulberry wine during main fermentation process

结果表明,桑椹果汁和发酵醪中有机酸的种类和含量存在明显差异。桑椹果汁中苹果酸、酒石酸、柠檬酸含量较高,草酸和丁二酸含量较低,不含有α-酮戊二酸和乳酸,这与文连奎等[26]的报道相吻合。与桑椹果汁相比,桑椹发酵醪中有机酸种类增多,新生成α-酮戊二酸和乳酸。在桑椹果酒主发酵过程中,除草酸含量降低以外,其它有机酸含量都有不同程度的增加,其中,苹果酸含量呈缓慢上升的趋势,其最终含量为0.812 g/L;酒石酸和柠檬酸的变化规律相似,都在第1 d时大量生成,此后随着发酵的进行,酒石酸和柠檬酸含量先升高后降低,在发酵第3 d时其含量达到最高,分别为2.949、1.540 g/L;草酸和α-酮戊二酸含量始终维持在较低水平,其最终含量分别为0.122、0.107 g/L;乳酸、丁二酸随着发酵时间的延长不断积累,最终含量分别为2.303、1.079 g/L。

在桑椹果酒发酵初期(0～2 d),糖类物质作为主要的发酵基质被大量代谢成酸类、醇类及其它类物质,在此期间,有机酸大量生成,其中酒石酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸含量急剧上升,草酸、α-酮戊二酸、苹果酸含量小幅增加;在桑椹果酒发酵中期(3～5 d),由于发酵醪中总糖含量降低,酵母能利用的发酵基质减少,转化为酸的量也随之减少,从而导致发酵醪中有机酸增长速率减慢,部分有机酸(如酒石酸、苹果酸、柠檬酸)含量达到最高;在桑椹果酒发酵后期(6～7 d),各种有机酸含量变化不一,造成这种变化的原因可能有:各种有机酸相互转化,为细胞内物质的合成提供中间体;有机酸被彻底氧化,为细胞活动和物质的合成代谢提供能量。如,继酒精发酵后的苹果酸-乳酸发酵[27]使苹果酸不断向乳酸合成的方向转化,导致乳酸含量不断升高,而苹果酸自身含量变化不大;酒石酸的降解也会增加乳酸的含量;发酵后期由于营养物质的缺乏,柠檬酸也会被当作底物被部分消耗,从而生成α-酮戊二酸、丁二酸等物质。

2.6 桑椹果酒发酵过程中感官变化情况

在桑椹果酒主发酵过程中,感官形态在一定程度上反应果酒的成熟程度和品质,其变化情况见表3。

表3 不同发酵阶段桑椹果酒的感官记录Table 3 Sensory analysis records of mulberry wine at different stages of fermentation process

醇类和酯类物质是构成桑椹果酒香气的重要组成成分,其中醇类物质赋予桑椹果酒浓郁的酒香,酯类物质则构成果酒独特的水果香气和酯香[28]。随着发酵的不断进行,桑椹果醪中丰富的糖类物质在酵母的作用下被逐渐代谢形成醇类、酸类等物质,随后醇类和酸类物质通过脱羧作用进一步生成酯类物质。由表3可知,发酵第3 d,桑椹果酒开始呈现出较浓的酒香味,但味道淡薄,缺乏典型性,这是由于酒精主要产生在桑椹果酒发酵前期,到发酵第3 d时其含量达到最高,所以有较浓的酒香味,但此时果酒中香气物质单一,香味并不协调;而发酵后期果酒中醇类物质和酸类物质通过酯化反应生成酯类物质,赋予果酒酯香,进一步丰富了果酒香气,使酒香馥郁,桑椹果酒发酵6 d后,酒体外观颜色呈紫红色,光泽感强,无悬浮物和沉淀,且果香浓郁,酒香馥郁,柔和爽口,具有桑椹果酒典型性,其感官形态基本达到最佳。

3 结论

桑椹果酒主发酵阶段,pH先从4.32下降至4.06,后上升至4.22,总酸的变化与pH相反,其最终含量为4.31 g/L;挥发酸、干浸出物含量不断升高,到发酵结束时其含量分别为0.72、20.15 g/L;总糖含量逐渐降低,从149.46 g/L下降到1.55 g/L,与此对应的是酒精度从0%vol由上升至7.22%vol;桑椹果酒中含量较高的有机酸为酒石酸、乳酸、柠檬酸,其最终含量分别为2.184、2.303、1.115 g/L;经感官评价,发酵6 d后的桑椹果酒感官形态基本达到最佳。

桑椹果酒主发酵前2 d是物质变化最活跃的阶段,在此期间糖类物质被大量消耗,同时各种代谢产物迅速生成,而随着发酵进入中期,各物质仍呈现出不同程度的变化,但变化趋势较初期有所减缓,到果酒发酵第6 d时,各类物质含量达到稳定,说明主发酵过程已到达较好的效果,可以进入后发酵阶段。