不同肥料处理对烟叶机械承受能力的影响及其机制研究

何海丽，黄 强，代瑾然，廖菊够，王建光，吴金虎，王继明，郑元仙，吴 剑，何元胜，魏 佳，许银莲，周厚发，陈穗云*

(1.云南大学生命科学学院植物科学研究所，云南 昆明 650091；2.云南省烟草公司临沧市公司，云南 临沧 677099)

植物叶片折断或脱落的现象十分复杂，根据折断、脱落发生的时期，通常将叶片折断分为两种情况，一种是叶片正常成熟衰老后自然脱落；另外一种是叶片在未成熟的正常生长时期，受到外力影响而过早从叶柄处折断[1]。【研究意义】烟草是世界上广泛种植的重要经济作物之一，经济价值最高的中部或中部偏下的烟叶，在处于快速生长尚未达到成熟的时期，受到较大风、雨或人畜走动触碰等外力因素后，易从叶柄近基部折断，这种机械折损给烟叶生产造成重大经济损失。其出现的原因和机理目前在国内外鲜见报道。【前人研究进展】烟叶这种非正常折断原因的推测和研究可以借鉴作物茎杆倒伏的研究。目前对作物抗倒伏研究较多的是水稻、小麦、玉米和油菜等作物[2]。烟草的经济器官主要是叶片，主叶脉结构的完整性是保证叶脉抗折损、叶片正常发育成熟必不可少的因素，影响结构发育成熟的因素包括温度、湿度、光照强度、土壤中的水分及营养物质含量等，在同等气候条件下，营养物质是影响烟草叶脉结构完整性的主要因素[3]。研究表明，不同的肥料处理能够提高农作物抗倒伏的能力[4]。作物茎杆中木质素含量与茎杆强度具有相关性，提高木质素含量能够有效提高作物抗倒伏的能力[5]。过氧化物酶(POD)和L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)是木质素合成的限速酶，提高它们的酶活性能促进木质素的合成[6]。茎杆的抗倒伏能力与茎杆的解剖学结构密切相关[7]。凌启鸿、吴泽芳等研究认为茎杆组织结构包括维管束数目及厚壁细胞厚度与抗倒伏呈正相关[8]。水稻茎杆的抗倒性与茎杆的机械强度成正比，茎杆机械强度与维管束的数目、大小、分布等密切相关，维管束数目越多，抗倒伏能力越强[9]。【本研究的切入点】由于不同肥料处理会对作物抗倒伏能力、作物茎杆中木质素含量及茎杆机械强度产生影响。因此，合理施用肥料对增强烟叶机械承受能力、降低烟叶田间折断率具有重要意义。【拟解决的关键问题】本试验用不同的肥料处理临沧市的主栽烤烟云烟87，检测不同处理对烟叶最大机械承受能力的影响，测定木质素含量及其合成过程中关键酶POD和PAL活性，通过石蜡切片观察易折断和抗折断烟叶主叶脉解剖结构的特征与差异，研究其作用机制，为降低烟叶田间机械折断率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地基本情况

试验于2016年3-11月在临沧市临翔区博尚镇永泉村大田实验基地进行。土壤类型为壤土，前茬作物为油菜，土壤pH值为5.36，有机质2.65 %，水解性氮126.1 mg/kg，有效磷95.7 mg/kg，速效钾 72 mg/kg，有效硼0.72 mg/kg，有效锌4.07 mg/kg。

1.2 试验设计

试验为同田对比试验，设7个处理组和1个对照组。各处理在对照组的施肥基础上，分别增施不同种类的肥料，具体肥料种类、用量、施用时期和方法如表1所示。

表1 肥料种类、用量、施用时期和方法

种植面积0.268～0.335 hm2，每个处理种植不少于100株，随机重复3次，行株距120 cm×50 cm。试验地选择有代表性、土壤肥力均匀、地面平整、排灌方便、肥力中上等水平的同一地块。其它栽培管理措施按照当地烤烟生产规范要求进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 机械折断率测定 在烤烟移栽后70、90和110 d选取长势良好、均一、3个叶位烟叶的主叶脉大小分别相近、无病虫害的植株，采用砝码测试的方法分别检测脚叶、下二棚、腰叶3个部位的最大机械承受重量。测试方法：将砝码装入自封袋，用夹子同时夹住自封袋口和离叶柄基部1/3位置处的主叶脉，使装有砝码的自封袋悬垂于空中，从100 g起始，每次增加5 g，观察烟叶是否折断，每个时期及每个部位随机统计25株，每株每个部位测定3～4片叶。记录造成这3个叶位烟叶折断的最大砝码重量，对应为相应叶位的最大承受重力。最后分别计算出对照组不同部位的烟叶的平均最大承受重量。通过测试结果确定了各部位烟叶的平均最大承受重量如下：脚叶(第1～3片)，距离地面约20 cm，砝码重量为410 g；下二棚(第4～6片)，距地面约30 cm，砝码重量为380 g；腰叶(第7～16片)，距地面约50 cm，砝码重量为350 g。用该平均重量去检验各个处理组的烟叶承受能力，将每个处理各部位折断的叶片数除以该部位测试总叶片数即为机械折断率。

1.3.2 木质素含量测定 分别测定各个时期3个叶位折断烟叶和非折断烟叶主叶脉的木质素含量。木质素含量按照参考文献[10]的方法测定，结果以A280 nm下的吸光值表示。

1.3.3 POD活性测定 分别测定各时期3个叶位折断烟叶和非折断烟叶叶肉组织中过氧化物酶活性。POD活性按照参考文献[11]的方法测定。

1.3.4 PAL活性测定 分别测定各时期3个叶位折断烟叶和非折断烟叶叶肉组织中L-苯丙氨酸解氨酶活性。PAL活性参照张志良等[12]的方法测定。

1.4 解剖结构的观察

取各时期3个叶位折断烟叶和非折断烟叶离茎杆基部约2 cm处的主叶脉，切成0.5～0.8 cm的小段，用FAA固定液固定保存。采用石蜡切片法切成8 μm的薄片，番红-固绿双重染色，中性树胶封片，用显微镜观察主叶脉横切面的机械组织、木质部、维管束等结构。

1.5 数据分析方法

所有统计数据均采用Graghpad Prism 6.01作图，并用SPSS 19.0进行数据处理和统计分析。用单因素方差分析各个处理组在不同移栽时间及不同部位的折断率、木质素含量、酶活性和维管束厚度的差异，最后用post-hoc比较各个肥料处理间的差异。用不成对的t检验比较易折损组与抗折损组在木质素含量和酶活性中的差异。

2 结果与分析

2.1 肥料处理对烟叶机械折断率的影响

肥料处理对烟叶机械折断率会产生不同程度的影响，如图1所示，增施不同肥料后，各部位烟叶折断率与常规施肥(CK)对比发现，T2处理(硫酸钾)、T3处理(农用硼砂)、T4处理(水溶性有机钾)、T5处理(水溶性有机钾+喷施含微量元素的菌肥)和T6处理(含微量元素的菌肥)的脚叶、下二棚、腰叶的折断率在移栽后70、90和110 d分别都比CK相应时期对应部位折断率低，具有显著差异(P<0.05)。T1处理(农用硫酸锌)移栽后70 d，脚叶折断率较CK折断率低，具有显著差异(P<0.05)，而其下二棚、腰叶折断率与CK组无显著差异(P>0.05)；T1处理移栽后90 d，腰叶的折断率与CK相比，无显著性差异(P>0.05)，脚叶和下二棚的折断率与CK相比有所减少(P<0.05)；T1处理移栽后110 d，与CK相比，脚叶和下二棚的折断率没有显著性变化(P>0.05)，腰叶的折断率有所减少(P<0.05)。T7处理(微生物菌肥+含微量元素的菌肥)移栽后70 d，与CK相比，脚叶和腰叶折断率均无显著差异(P>0.05)，下二棚有所增加(P<0.05)；T7处理移栽后90 d，脚叶和腰叶与CK相比折断率均无显著差异(P>0.05)，下二棚与CK相比显著增加(P<0.05)；T7处理移栽后110 d，脚叶、下二棚和腰叶与CK相比均无显著差异(P>0.05)。相比之下，T7处理在不同移栽时期及不同部位均显示较高的折断率，T5处理及T6处理在移栽后70 d均表现出较显著的抗折断效果，T3处理在移栽后90 d呈现出较显著的抗折断效果，T2处理在移栽后110 d的脚叶和下二棚表现出最显著的抗折断效果。

组内不同字母表示各肥料处理组之间的显著性差异(P<0.05)，下同Bars within groups with different letters indicated significant differences among the fertilizer treatments (P<0.05). The same as below图1 不同肥料处理对云烟87烟叶机械折断率的影响Fig.1 The effect of different fertilizers on the rate of mechanical fracture of tobacco leaves

图2 易折断与抗折断的烟叶中木质含量差异Fig.2 The difference of lignin content between easy fracture leaves and fracture resistant leaves

图3 烟叶机械承受能力与木质素含量的相关性分析Fig.3 The correlated analysis of tobacco leaves mechanical strength and lignin content

2.2 烟叶机械承受能力与木质素含量相关性

为检验烟叶机械承受能力是否与木质素含量相关，测定易折断的烟叶与不易折断的烟叶的木质素含量，结果如图2所示。与不易折损的烟叶相比，不同叶位易折断烟叶的主叶脉中的木质素含量在移栽后70 d均显著偏低(P<0.05)。移栽后90 d，易折损的脚叶与不易折损的脚叶的木质素含量没有统计学差异(P>0.05)；下二棚和腰叶，不易折断的叶脉木质素含量比易折断组高(P<0.05)，移栽后110 d，易折损与抗折损的烟叶的木质素含量在下二棚没有显著性差异(P>0.05)，脚叶和腰叶均有显著性差异(P<0.05)。通过测定不同烟叶的木质素含量及其最大承受机械重量，将结果做关联性分析，结果如图3所示，烟叶所能承受的最大重量与主叶脉中的木质素含量呈正相关。

2.3 不同肥料处理对烟叶中木质素含量的影响

不同肥料处理组木质素含量变化如图4所示，移栽后70 d，T1处理的木质素含量与CK处理在脚叶有所增加，而下二棚和腰叶没有显著性变化(P>0.05)；移栽后90 和110 d，T1处理的木质素含量在脚叶和腰叶与CK相比均无显著性差异(P>0.05)。移栽后70、90和110 d，T2、T3、T4处理的木质素含量在脚叶和腰叶与CK相比均有显著性增加(P<0.05)。T7处理在移栽后70 d脚叶木质素含量与CK相比显著增加(P<0.05)，下二棚和腰叶没有显著性变化(P>0.05)，移栽90和110 d的脚叶、下二棚和腰叶与CK相比均无显著性变化(P>0.05)。相比之下，T2处理的木质素含量在移栽后110 d的脚叶最高；T3处理的木质素含量在移栽后90 d的不同部位最高；T6处理的木质素含量在移栽后70 d的下二棚和腰叶均最高，在移栽后110 d的下二棚和腰叶最高。

2.4 POD和PAL活性对烟叶木质素含量的影响

易折断与抗折断的烟叶的POD活性变化如图5所示，移栽后70、90和110 d，抗折损的烟叶POD活性在脚叶、下二棚和腰叶均比易折损烟叶高(P<0.05)。

图4 不同肥料处理对云烟87烟叶中的木质素含量的影响Fig.4 The effect of different fertilizers on the lignine content of tobacco leaves

易折断与不易折断的烟叶中木质素合成关键酶(PAL)的活性如图6所示，移栽后70、90和110 d，不易折损的烟叶的PAL活性在脚叶、下二棚和腰叶均比易折损烟叶高(P<0.05)。

2.5 不同肥料处理对烟叶主叶脉结构的影响

易折断与不易折断烟叶主叶脉的结构如图7所示，易折断烟叶的叶脉木质部中维管束的厚度比不易折断烟叶小，维管束数目相对较少，相邻维管束间的距离相对较大，维管束外组织细胞排列相对疏松，而且单个维管束比较薄。移栽后70、90和110 d，不易折损的烟叶维管束层的厚度在脚叶、下二棚和腰叶都比易折损烟叶大。

不同肥料处理组烟叶主叶脉中的维管束厚度变化如图8所示，移栽后90 d，T1处理的维管束厚度在腰叶和下二棚较CK有显著增加(P<0.05)，而在脚叶没有显著性变化(P>0.05)，T2、T3、T4、T5

图5 易折断与抗折断的烟叶中POD活性差异Fig.5 The difference of POD activity between easy fracture leaves and fracture resistant leaves of tobacco

图6 易折断与抗折断的烟叶中PAL活性差异Fig.6 The difference of PAL activity between easy fracture leaves and fracture resistant leaves of tobacco

图7 易折损与抗折损的烟叶主叶脉横切面结构比较Fig.7 The transverse section difference of the structure of main leaf vein between easy fracture leaves and fracture resistant leaves

图8 不同肥料处理对移栽后90 d烟叶中的主叶脉中维管束厚度的影响Fig.8 The effect of different fertilizers on vascular bundle thickness in main leaf vein of tobacco leaves

和T6处理中的维管束层厚度在脚叶、下二棚和腰叶与CK相比均显著性增加(P<0.05)。T7处理的维管束厚度与CK相比在脚叶和腰叶均无显著性变化(P>0.05)，在下二棚较CK有显著增加(P<0.05)。

3 讨 论

研究已明确，不同的肥料处理对烟叶的机械承受能力会造成不同的影响，硫酸钾、硼砂、水溶性有机钾、水溶性有机钾+喷施含微量元素的菌肥和含微量元素的菌肥处理云烟87，在移栽后70、90和110 d均能显著减少脚叶、下二棚和腰叶的折断率。有大量研究还表明用氮肥或钾肥处理农作物能影响农作物的组织结构发育，提高作物茎杆的韧性，从而起到抗倒伏的作用[13]。在作物生长及发育时期，肥料中的大量元素及微量元素对于植物茎杆及叶脉的结构形成起到非常重要的作用。烟叶的折断与农作物的倒伏相似，都是由自身抗机械折损能力及环境因素共同作用的结果[3,14]。研究显示，不同肥料处理对烟叶的机械折断率都有不同程度的影响，但不是任意肥料都能发挥类似的效果。硫酸锌和含有微量元素的菌肥在抗机械折断中的作用并不突出，在不同时期及不同部位无法呈现一致性变化，这种现象可能与作物不同部位及不同时期对肥料需求的多变性相关[3]。当然肥料作用有其局限性，可能与施肥的浓度及施肥的方式也有关，另外气候因素、生态因素对其也会有影响。其它的五个处理在不同时期及不同部位都呈现出一致性变化，说明钾肥、硼肥及微量元素能够提高烟叶抗机械折断能力。

在植物抗倒伏研究中，作物茎杆中木质素含量高低是判断作物抗倒伏能力的一个重要指标[15]。在细胞壁木质化过程中，木质素逐渐渗入细胞壁，填充于纤维素构架中，增强了植物体的机械强度，利于疏导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭[16]。因此，木质素的含量与作物茎杆的刚性密切相关。植物茎杆中木质素含量越大，植物的抗折力就会越强[17]。由此推断，烟叶机械折断的发生与主叶脉中的木质素含量偏低有关。研究显示，相较于抗折断的烟叶，易折损的烟叶主叶脉木质素含量普遍偏低，不同叶位及不同时期都呈现出一致性变化趋势，烟叶的最大机械承受能力与主叶脉中的木质素含量呈正相关。表明烟叶的田间机械折断与其木质素含量密切相关[18]。用硫酸钾、硼砂、水溶性有机钾、水溶性有机钾+喷施含微量元素的菌肥和含微量元素的菌肥处理云烟87后，在移栽后70、90和110 d均能显著增加脚叶、下二棚和腰叶木质素含量，结果与其抗机械折断作用一致。表明上述肥料起抗机械折断作用主要是由于主叶脉的木质素含量增加[4]。

研究表明，POD和PAL是木质素合成过程中的关键酶，它们的活性与木质素的含量息息相关[19]。POD是植物体中活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化[20]。过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，因此，过氧化物酶的活性是植物体酶活力的标志[15]。PAL是莽草酸途径中的一个限速酶，它主要通过催化苯丙氨酸的脱氨反应，使NH3释放出来形成反式肉桂酸，此酶在植物体内次生物质(如木质素等)代谢中起重要作用，该酶的活性下降会直接导致木质素的合成量减少[5]。实验结果表明易折断的烟叶主叶脉中POD活性和PAL活性都显著低于抗折断组。同时这2个酶的活性与木质素含量成正相关。说明肥料处理可能是通过影响木质素合成关键酶来影响木质素含量，从而影响其机械承受能力。木质素是构成植物机械组织的主要成分之一，木质素的减少会影响机械组织的正常形成，导致植物组织结构的异常，最终促使植物茎秆强度降低使其容易折损[20]。

作物的抗倒伏性与茎杆机械强度成正比，维管束数目越多，抗倒伏能力越强。茎杆中维管束长度和宽度是评价茎杆质量优劣的良好指标[2]。实验的显微结构结果中发现易折断烟叶主叶脉的维管束厚度与抗折断组具有显著性差异，易折断组的维管束层厚度较小，同时单个维管束的厚度也比抗折断组小。通过肥料处理能够增加烟叶维管束层的厚度，与其对木质素含量以及抗机械折损的结果一致。

4 结 论

对云烟87增施硫酸钾、硼砂、水溶性有机钾、水溶性有机钾+喷施含微量元素的菌肥和含微量元素的菌肥后，脚叶、下二棚和腰叶主叶脉中木质素含量提高，木质素合成关键酶POD和PAL活性增大，烟叶主叶脉中维管束厚度和机械强度增加，烟叶机械承受能力显著增强，田间折断率降低。