烟草苗移栽后室内与田间根结线虫幼虫侵染动态检测

李宏光，余 萍，阙劲松，刘春明，BUDAHN Holger，李勇军，朋金娥，罗红梅，张绍松*

(1.云南省烟草公司红河州公司，云南 弥勒 652300；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室/云南省农业生物技术重点实验室，云南 昆明 650223；3.Julius Kühn-Institut, Institute for Breeding Research on Horticultural Crops, Quedlinburg 06484)

【研究意义】植物寄生线虫是农作物的一大类病害，全球农业生产因其每年造成的损失约1570亿美元[1]。根结线虫(Root-knot nematode)是植物寄生线虫病原中一个重要属，该属有90多个种，寄主多达5500多种植物[2]，如该属的南方根结线虫(Meloidogyneincognita)几乎可侵染所有的栽培植物[3]。根结线虫是烟草生产中的主要病害之一[4]，根据2002年的中国烟草业统计，全国根结线虫发生面积为10.83万hm2，直接危害造成的烟叶经济损失达7917.84万元，占侵染性病害所致损失的5.7 %[5]。由于根结线虫病害在农业生产中造成重大经济损失，国内外众多学者对该病害从多角度进行了研究。【前人研究进展】在病原根结线虫侵染寄主方面，作者曾对根结线虫分离和苗期接种方法进行了探索[6]；李秀花等探索出“一种准确测定土壤根结线虫种群数量的方法”[7]；时立波等对根围土壤根结线虫二龄幼虫与自由生活线虫数量的关系进行了研究[8]；Jun-hai Niu等研发出对土壤和根中根结线虫属4个种的快速检测方法[9]；作者对病原根结线虫的染色方法进行了研究[10]；巩彪等则从大蒜秸秆对根结线虫及根际微生态互作方面进行了探讨[11]。国内外一些学者对病原侵入寄主根系组织病理学方面进行了研究[12-18]；可见，有关病原种群及其侵染寄主就有众多的研究报道，但未见有关移栽初期病原侵染寄主状态的报道。【本研究切入点】文章针对病原侵染寄主的初期，探索根际土壤中病原种群、数量和侵染寄主根组织的动态。【拟解决的关键问题】探明重病的烤烟田病原根结线虫种群及其移栽初期侵染动态，为该病害有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烟草种子与烟苗 烟草(NicotianatabacumLinn)品种：室内和田间试验的烟草品种均为红花大金元。室内试验的种子由云南省烟草公司红河州公司提供，育苗常规基质选用云南省弥勒市烟用物资有限责任公司的产品，烟苗培育参见文献[19]，田间试验的种子和烟苗由红河州烟草公司建水县分公司提供。

1.1.2 烟田病圃与病原根结线虫雌虫 红河州建水县南庄烟站片区，在烤烟采烤结束，根据前期烟株生长状况和烟农采烤烟叶情况，分析烟田中根结线虫危害严重，将其作为病圃，挖取烟株根系及其根际土壤，作为病圃土在室内进行烟苗移栽试验，并从根系采集病原根结线虫的雌虫，用于种群分析。同时，作为下一年田间试验的病圃。

1.1.3 染料及其染液配制 病原根结线虫雌虫会阴花纹与根系组织内J2的染色观察参见文献[10]，分别采用Cochenille Red A(德国AppiChem公司)和溴酚蓝(天津市瑞金特化学品有限公司)，2种染液的配制方法同文献[10]。

1.1.4 试剂 次氯酸钠(有效氯天津市富宇精细化化工有限公司，AR)；无水乙醇(四川西陇化工有限公司，AR)；异丁醇(西陇化工股份有限公司，AR)；蔗糖(天津市瑞金特化学品有限公司，CR)。

1.1.5 仪器 解剖镜和显微镜：Olympus SZX10解剖镜、Olympus BX51光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 烟田病圃土及病株根系取样 病株根系与根际病圃土取样：2013年9月23日，通过烟田挖根调查和分析，确定根结线虫病危害严重的烟田，农户采烤烟叶结束后，采用5点取样法，在烟田中选5个点，依次编号为A、B、C、D和E，每个点挖取3株根系，以A1、A2和A3;B1,B2……分别编号。同时，挖取每株根际土壤约30 kg，装入蛇皮袋，装运回云南省农科院生物技术与种质资源研究所，用于雌虫采集，种群分析和室内移栽烟苗的侵染试验。

烟苗移栽前病圃土取样：2014年4月15日，前往上述建水县南庄根结线虫病害发生较重的烟田，农户已对前茬烟桩进行了翻耕处理。病圃土的采集采用5点取样法，在烟田中选5个点，依次编号为A、B、C、D和E，每个点在约5 m2烟田的范围内，铲除表层5 cm的土壤，挖取烟田病圃土壤3袋，约500 g/袋，装入自封袋中，每袋作为该点的1个重复，装运回云南省农科院生物技术与种质资源研究所，用于检测移栽烟苗前烟田病圃土单位体积中二龄幼虫的数量。

1.2.2 烟草病株上根结线虫雌虫采集与会阴花纹观察 雌虫采集：从云南省建水县南庄烟田采集的烟株根系，洗去根系土，按编号依次在每株烟根系上选3～5个根结，用手术刀直接将根结剖开，置于解剖镜下，挑取根结线虫的雌虫。每株烟挑取10条雌虫。

雌虫会阴部分切片、染色制片和显微观察：雌虫会阴部分制片与观察方法同文献[10]。

1.2.3 病株根际土壤单位体积中线虫J2数量检测 上述在2014年4月15日，以5点取样法获得的15袋烟田土壤，按编号依次量取50 mL土壤，并分别称重。土壤中J2幼虫数量检测方法同文献[6]和[10]，采用高渗蔗糖溶液分离与分样筛分离相结合的分离方法，并在解剖镜下测定每个土壤样品单位体积中线虫J2数量。

1.2.4 烟苗培育、田间与室内病圃土中移栽 室内试验的烟苗培育：取红花大金元品种的种子，用169穴/盘的漂盘和烟草育苗专用基质，点种培养4盘，在室内采用漂浮育苗常规方法[19]育苗。

室内病圃土盆栽：上述9月23日从建水县南庄采回的病圃土，从蛇皮袋中倒出，拌匀。取底部有孔的塑料瓶[6]，将采集的病圃土分装入塑料瓶中(约1 kg/瓶)，共150瓶。

田间试验烟苗与移栽：烟苗由建水县烟草分公司南庄烟站育苗点常规漂浮育苗培养的红花大金元品种的健壮烟苗中取150株，苗龄约50 d，采用常规移栽方法，2014年4月29日，将烟苗移栽至发病较严重的烟田病圃中，其余病圃田同时栽种红花大金元品种的烟苗，浇适量定根水。

室内试验烟苗与移栽：通过常规漂浮育苗法培育的红花大金元品种健壮烟苗中取150株，苗龄为50 d，2013年10月7日，分别将烟苗移栽至装有病圃土的塑料瓶中，1苗/瓶，浇适量定根水(约100 mL)。

烟苗培养：将上述移栽至塑料瓶中的烟苗置于培养间中培养，光照时间为每天12 h；白天室内气温为25 ℃(由培养间中安装的空调调节)、土壤温度约22 ℃，与光照的开关时间同步；夜间室内气温自然(约14～16 ℃，空调关闭)。根据烟苗生长状况，适时浇水。田间试验烟苗按常规烤烟种植方法管理。

1.2.5 田间和室内烟苗移栽初期根系组织中病原根结线虫检测 烟苗移栽后，从第6天开始，每3 d取样1次，室内与田间每次随机取样20株完整的烟苗与根系。建水南庄试验田的取样烟苗当天经快递送达云南省农科院生物技术与种质资源研究所，当天采用溴酚蓝染色法进行检测。取清洗干净的根系组织，参照文献[10，20]，在0.5 %(1 %的次氯酸钠溶液中，浸泡4(8 h；水洗后，在50 %酒精溶液中浸泡5 min；在溴酚蓝染液中染色4 h，显出细微结构后，用0.1 %稀染液复染12(16 h，依次用50 %、70 %酒精和70 %异丁醇处理20 min，用水冲洗干净，待镜检。

经染色处理和水洗后的根系样品，在解剖镜下从根尖至根基部逐株检查。发现有J2幼虫侵入根系组织的部位，用解剖刀切下根段置于载玻片上，再用OlympusBX51光学显微镜观察，调节清晰度，利用Olympus DP-70成像系统采集图像(一般为4×或10×物镜下采集)。

2 结果与分析

2.1 烟田病圃烟株根系中根结线虫种群调查

建水县南庄根结线虫病危害严重的烟田(约0.2 hm2)，烟叶采烤完后(9月)，按5点采样法，每点挖取3株根系，共采集15病株，从每一病株根结部位挑取约10条雌虫，共挑取171条雌虫，通过染色、制片，置显微镜下观察会阴花纹，结果如表1所示。烟株根系的病原线虫种类共有3种，分别为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，未发现北方根结线虫。花生根结线虫为该烟田中的优势种群，占观察雌虫总数的52.6 %，爪哇根结线虫次之，南方根结线虫种群较低。5个采样点中，只有A采样点病株中，爪哇根结线虫种群略显优势(42.4 %)。A、B、C和D的4个采样点中均有病株，未检查到南方根结线虫。

表1 烟株根系中病原根结线虫种群

表2 烟株根际土壤单位体积(50 mL)中J2数量

表3 室内移栽烟苗后侵染初期根组织内病原根结线虫J2调查

2.2 病圃烟株根际土壤中线虫J2数量检测

移栽烟苗前7 d(4月15日)，烟田已翻犁过，按5点取样区域，每点采集3个样品。通过蔗糖溶液离心分离与分样筛收集相结合的方法[5]，将每一土壤样品中收集到的J2，在解剖镜下统计J2数量，结果参见表2。

表2中5个点15个样品的检测数据显示，50 mL土样中J2平均数量为8.4条，经方差分析，5个采样点的单位体积根际土壤中线虫J2数量差异显著(F=6.18>F0.05=5.96)，表明烟田不同区位，单位体积根际土壤中J2数量存在明显的差异。调查的结果显示，同一块烟田的不同重复小区根结线虫危害程度差异极大，同一重复小区的不同烟株间，危害程度也存在差异。从15个土壤样品分离收集到的126条J2中，较为活跃的有25条(19.8 %)。解剖镜观察幼虫形状，约80 %的幼虫已不动和僵化，推测其已丧失侵染性。此外，前茬烤烟采烤结束时间为2013年9月上旬，此次采集土壤样品时间为2014年4月15日，期间经历冬季共7个月，故检测到的J2多数已死亡，推测检测到较活跃的幼虫是土壤中孵化成长的J2。

2.3 室内病圃土中移栽烟苗初期病原根结线虫侵染调查

将烟苗移栽在花盆内根结线虫病危害严重的病圃土中，自移栽后第6天开始，每3 d采集20株生长健壮的烟苗根系，共调查了6次。采用溴酚蓝染色法，在显微镜下观测侵入每株烟苗根系的二龄幼虫，结果见表3。

从烟苗移栽后的第6天开始，已检测到根结线虫的二龄幼虫侵入烟株的根组织中，或许有的更早。移栽后第9天，大部分植株的根系中存在J2的侵染，呈现J2侵染烟株根系的高峰期。在检测的根系组织样品中，部分未检测到幼虫；有些只在1根的根毛组织内检测到1条幼虫(图1A)；如有植株1根的根毛组织中发现2条(图1B)或3条(图1C)；多的则有5条(图1D)。移栽后第12天开始，烟株根系组织中，J2的数量呈现明显下降的趋势。在显微镜下观测的结果显示，自移栽后15 d，烟株的部分根系开始变粗，其表皮变厚，溴酚蓝染液较难渗透到根组织内部，根组织内的幼虫，一般在新长出的根毛组织内。究其原因，自移栽后12 d开始，侵染入烟苗根系组织的J2数量呈现出减少的趋势，是因为随着烟苗的生长，早期长出的根系变粗变厚，经染色未能使幼虫着色，显微镜下观测不到根组织内幼虫[10]，观测到的是新长出根组织内的幼虫。此外，二龄幼虫侵染入根组织内，建立起取食位点(Feeding site)，形成巨型细胞[21]，雌虫开始进一步发育，虫体变短变粗，巨型细胞也变大，在根毛外形上该部位显现出根结(Gall)的形状。此时，溴酚蓝染液较难使雌虫着色。因此，对根结线虫幼虫侵染入根系组织的观测最佳时期应掌握在烟苗移栽后的15 d内。

图1 根结线虫侵入烟草不同根毛组织中J2Fig.1 J2 of root-knot nematode infected into different root tissue of tobacco

调查项目Item移栽后天数(d)Days after transplanting6912151821调查植株数202020202020侵染植株数112943侵染根数1131274根内线虫总数114221526单株根内J2平均0.050.050.21.10.751.3

2.4 烟田病圃中移栽烟苗初期病原根结线虫侵染调查

与室内移栽初期调查的时间和方法相同，在烟田移栽烟草苗后，经取样和检测，结果见表4。

在田间移栽烟苗的调查结果表明，第6天采集的20株烟苗中，只有1株烟苗的根系被1条幼虫侵染，明显比室内侵染率低。此后，被侵染植株的数量和侵染入根系组织内的幼虫数量逐渐上升，至移栽后15 d，呈现第1个侵染高峰期，此后有下降趋势，接着又出现侵染数量增加的现象。与室内试验相比，相同之处：移栽后6 d(第1次)均已检测到根系组织内J2；室内与田间试验均出现侵染的高峰时期;；侵染高峰期后，均出现侵染的植株数和侵入根系组织内的幼虫数减少的趋势，推测其原因如上所述。不同之处：第1次调查(移栽后第6天)，室内的受侵染植株数与侵入根组织内的J2数量均显著高于田间，推测与试验时间有关，室内试验在烤烟采烤结束约1个月即移栽，此时土壤中含有相当数量的活幼虫，有可能在较短的时间内侵入烟苗根系组织内，而田间试验则距烤烟采烤结束时间约7个月，J2在田间不能存活几个月的时间，推测侵入根系组织的J2为刚孵化不久的幼虫；出现侵染高峰的时间有差异，室内的侵染高峰期为移栽烟苗后第9天，田间试验则在第15天，此后第21天还出现更高侵染率，此现象进一步说明侵入根组织内的J2极有可能是由虫卵刚孵化的幼虫，因而，随着烟株生长的进程会出现不同的侵染高峰；室内的温度、光照、土壤水分等条件易于控制和稳定，田间则波动较大，呈现室内试验的侵染高峰期后J2数量迅速下降的趋势，而田间试验的下降趋势表现不突出。从曲线趋势，推测很有可能存在更高侵染率的高峰。但是，随着烟株和侵入根组织内J2的生长发育，早期侵入根组织内的已不能检测到，故在侵入根组织内15 d以上的侵染部位已形成凭眼可见的小根结(图2)。

图2 室内与田间根结线虫J2侵入根组织比较Fig.2 Comparing the J2 of root-knot nematode infected into tobacco root tissue between lab and field

3 讨 论

根结线虫最重要的传播途径之一为土壤携病原传播，农作物栽培过程中，种植地土壤中含有病原，是引发该病害发生、流行和爆发的根本原因。当栽培地土壤中含有病原，具备适宜寄主的温度、水分等条件，根结线虫病害的发生成为必然。云南省气候、土壤等条件较适宜于病原根结线虫的生长繁殖，仅烟草生产中每年该病害发生面积约2万hm2，重病田病株率达100 %，减产50 %[22]，给烟草产业带来极大的经济损失。根结线虫由虫卵变成成熟雌虫需经历4次脱皮，产生4种虫态，以二龄幼虫侵染入寄主组织内[23]。移栽烤烟苗时若土壤中含有大量的J2，易在移栽初期侵染寄主。据作者近期调查，移栽烟苗35 d，即发现烟株根系产生虫卵，该结果说明，从烟苗移栽至采烤完毕5个月的栽培过程中，有可能发生4次侵染循环，重复侵染烟株根系，多数植株的叶片变黄、变枯，即使进行烘烤，也不能获得具有价值的烟叶，导致绝产。如果病原在作物收割快结束时侵染，则对作物的产质量影响较小。所以，移栽初期对根结线虫病害进行防控显得极为重要。一般而言，根结线虫的虫卵可在土壤中存活较长时间，但J2在田间土壤中存活时间短，作者在室内分离收集的J2一般在室温下30 d虫体即僵硬，但在8 ℃的冷藏柜中60 d时，多数J2还在运动。因而，笔者认为，田间种植烟草的过程中，第一轮侵染循环中的J2，多数是从土壤中的虫卵孵化而来，若此判断正确，那么在田间防控移栽初期的侵染，其关键是防控土壤中虫卵的孵化。

本研究对病圃中的病原优势种群，田间移栽前病圃土壤中J2的数量进行了检测，比较了室内与田间烟苗移栽初期受根结线虫病原侵染的动态，初步表明，田间侵染寄主烟苗根系的病原根结线虫J2是从土壤中虫卵孵化而来。研究过程中，未对室内移栽的病圃土进行单位体积土壤中的J2数量检测，但笔者在烤烟田间栽培过程中，分不同时期进行过单位体积根际土壤中J2数量的检测，采烤烟叶结束后，发生根结线虫病害严重的烟株，其根际土壤的J2数量一般高于1000条/50 mL土，本研究中，室内移栽之前，已对采集的病圃土进行了翻拌混匀，距病圃中采烤结束时间约15 d，土壤中含有大量的活幼虫，故初期侵染较为严重。下一步，作者拟探索从土壤中检测根结线虫数量的方法，以便更好地从多角度探索病原根结线虫对农作物的初期侵染规律。

病原根结线虫已对越来越多的农作物构成严重的危害，病原侵染不同农作物的初期，具有共性。探明共性侵染机制，研发有效防控措施，可适用于多种农作物上根结线虫病害的防控。

4 结 论

烟田病圃中按种群优势依次分布有花生根结线虫(52.6 %)，爪哇根结线虫(31.6 %)和南方根结线虫(15.8 %)。移栽烟苗前烟田的50 mL土壤中平均J2数量为8.4条。分别在室内和烟田取样的 20株样品中，移栽烟苗后第6天均有植株被检测出根组织内有J2，移栽初期都出现侵染高峰期，但室内移栽的侵染高峰期更为明显，所需的时间短，侵染率显著高于田间试验。

致谢：鲁发周和段虎练同志在本研究中做了许多帮助，特此感谢！