痰标本PCR-反向斑点杂交法对疑似非结核分枝杆菌肺病的诊断价值

程丽平 张晓岩 沙巍

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是一种条件致病菌，在自然界中广泛存在[1]。近年来，随着NTM细菌学和分子生物学鉴定技术的发展、人们对NTM认识水平的提高、人获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)的流行及人口老龄化等诸多因素的影响，NTM病患者呈快速增多的趋势，已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[2]。NTM肺病因无典型的临床特异性症状和体征，且耐药率高，致病菌种繁多，对临床诊断及治疗造成极大的困难。

笔者通过回顾性研究，选择2014年1月至2017年10月同济大学附属上海市肺科医院结核科通过胸部CT检查临床疑诊为NTM肺病的患者，取患者痰液标本分别进行PCR-反向斑点杂交法行分枝杆菌菌种鉴定基因检测及分枝杆菌传统培养法[对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基生长试验]检测，比较两种检测方法的差异，评价以胸部CT检查为基础，联合应用PCR-反向斑点杂交法在NTM肺病诊断中的应用价值。

资料和方法

一、一般资料

1.患者来源及纳入标准：纳入2014年1月至2017年10月就诊于同济大学附属上海市肺科医院结核科临床疑诊为NTM肺病的患者，纳入患者均由2位结核科专科医师参考文献[2]和文献[3]进行诊断。所选取患者具有呼吸系统症状，采用德国西门子128排螺旋CT仪(SOMATOM Perspective)进行胸部CT检查，发现薄壁空洞影、多灶性支气管扩张及多发性小结节病变等；同时排除NTM并发结核分枝杆菌复合群(MTBC)混合感染、HIV感染、妊娠妇女、并发自身免疫系统疾病、有器官移植或免疫抑制剂用药史及其他脏器疾病终末期的人群。共纳入患者334例，其中男127例，女207例；年龄22～80岁，平均(59.29±13.13)岁。

2. 诊断标准：(1)NTM肺病诊断标准：痰NTM培养2次均为同一致病菌；支气管肺泡灌洗液(bronchoalvoelar lavage fluid，BALF)中NTM培养阳性1次，阳性度为++以上；BALF中NTM培养阳性1次，抗酸杆菌涂片阳性度为++以上；经支气管镜或其他途径进行肺活组织检查，发现分枝杆菌病的组织病理学特征性改变(肉芽肿性炎或抗酸染色阳性)，并且NTM培养阳性；肺活组织检查发现分枝杆菌病的组织病理学特征性改变，并且痰标本和(或)BALF中NTM培养阳性≥1次[2]。(2)肺结核诊断标准：参考《肺结核诊断和治疗指南》，痰液BACTEC MGIT 960法培养出MTBC；BALF标本BACTEC MGIT 960法培养出MTBC；支气管或肺部组织病理学检查证实为结核病变[4]。

3.临床资料：334例患者中，并发支气管扩张244例(73.05%)，肺内存在空洞137例(41.02%)，出现多发性小结节影107例(32.04%)，并发慢性阻塞性肺疾病87例(26.05%)，并发间质性肺病24例(7.19%)。

4.患者分组：(1)NTM肺病组。根据NTM肺病诊断依据，由2次痰液NTM培养阳性确诊180例；1次BALF中NTM培养阳性确诊42例；肺组织活检发现分枝杆菌的组织病理学特征性改变，且NTM培养阳性确诊7例；其中11例为痰液和BALF均阳性。共218例，其中男79例，女139例；年龄25～80岁，平均(57.13±12.98)岁。(2)结核病组。纳入的334例患者中，最终经痰液或BALF培养及MTBC菌种鉴定确诊肺结核40例，病理检查确诊肺结核2例；共42例，其中男19例，女23例；年龄22～72岁，平均(50.56±16.55)岁。(3)其他肺部疾病组。334例疑诊为NTM肺病的患者，最终诊断确定74例为其他肺部疾病患者，分别为支气管扩张并发感染56例，社区获得性肺炎10例，真菌性肺病3例，肺癌3例，慢性肺脓肿1例，结节病1例；在本研究的分析中予以排除；上述患者诊断均依据相关诊断标准[5-6]。

二、研究方法

标本来源于患者晨起漱口后的痰液标本。根据我国《结核病诊断细菌学检验规程》[7]进行预处理，以PCR-反向斑点杂交法行分枝杆菌菌种鉴定、基因检测，以及采用分枝杆菌传统培养法(PNB、TCH培养基生长试验)进行检测。

1.PCR-反向斑点杂交法行分枝杆菌菌种鉴定、基因检测：分枝杆菌菌种鉴定试剂盒、PCR扩增仪、分子杂交仪均由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。根据16S rRNA序列设计出23种特异的寡核苷酸探针，与生物素标记的PCR扩增产物进行杂交，通过膜条特定位置显色与否判断探针是否与该DNA片段杂交，鉴定临床上23种常见的致病性分枝杆菌。根据试剂盒的操作说明进行标本收集、样本处理、核酸提取、试剂配置及PCR扩增、分析和结果判读等。

2.分枝杆菌传统培养法：分枝杆菌生长试验采用“BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测系统”，试剂盒及仪器来源于碧迪医疗器械(上海)有限公司。对于培养阳性标本进一步接种至含有药物敏感性试验(简称“药敏试验”)所需标准浓度药物的MGIT培养管[含OADC增菌液；成分为油酸(oleic acid)、白蛋白(albumin)、右旋糖(dextrose)和过氧化氢酶(catalase medium)，简称“OADC”]及空白对照MGIT培养管(不含OADC增菌液)，然后置入仪器内进行培养，根据PNB及TCH的药敏试验结果可进行分枝杆菌菌种的初步鉴定，明确是MTBC或NTM。

三、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料以“例数”或“率”表示，采用χ2检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、分枝杆菌检测结果

根据胸部CT检查结果，疑诊NTM肺病的患者334例。其中，经涂片抗酸杆菌检测阳性206例(61.68%)，传统培养法检测阳性226例；菌种鉴定为NTM 191例，菌种鉴定为MTBC 35例，分枝杆菌培养法检出率为67.66%(226/334)。PCR-反向斑点杂交法检测阳性216例，其中菌种鉴定为NTM 183例，菌种鉴定为MTBC 33例；分枝杆菌PCR-反向斑点杂交法检出率为64.67%(216/334)。培养法及分枝杆菌PCR-反向斑点杂交法检出率的比较，差异无统计学意义(χ2=0.67，P=0.231)。

二、NTM肺病组采用2种检测方法进行检测的结果比较

218例NTM肺病组患者痰液PCR-反向斑点杂交法检测NTM阳性183例，以最终确诊情况为金标准，确认假阳性3例，敏感度为82.57%(180/218)，阳性预测值为98.36%(180/183)。PCR-反向斑点杂交法检测NTM阳性的183例分枝杆菌菌种鉴定结果见表1。传统培养法鉴定NTM阳性191例，以最终确诊情况为金标准，假阳性0例，敏感度为87.61%(191/218)，阳性预测值为100.00%(191/191)。两种方法检出NTM的敏感度比较，差异无统计学意义(χ2=1.20，P=0.169)。见表2、3。

表1 痰标本PCR-反向斑点杂交法检测NTM阳性患者的

三、结核病组采用2种检测方法进行检测的结果比较

结核病组患者PCR-反向斑点杂交法检测MTBC阳性33例，以最终确诊情况为金标准，假阳性0例，检测特异度为78.57%(33/42)，诊断结核病的阳性预测值为100.00%(33/33)。传统培养法检测MTBC阳性35例，以最终确诊情况为金标准，假阳性0例，检测特异度为83.33%(35/42)，诊断结核病的阳性预测值为100.00%(35/35)。两种检测方法特异度比较，差异无统计学意义(χ2=0.31，P=0.391)。见表2、3。

四、两组患者采用2种检测方法进行检测的一致率比较

将2种检测方法在两组患者中的检查结果进行对比，发现PCR-反向斑点杂交法进行检测的总体诊断符合率为83.08%(216/260)[注：符合率=(真阳性例数+真阴性例数)/(真阳性例数+假阳性例数+假阴性例数+真阴性例数)×100%]，传统培养法的总体诊断符合率为86.92%(226/260)，两种检测方法比较，差异无统计学意义(χ2=1.51，P=0.134)。进一步分析2种方法的检测结果，结果如表4所示。

表2 不同检测方法在两组患者中的检测结果比较

注a：χ2值和P值为2种检测方法与确诊患者实际诊断情况进行比较

表3 不同检测方法的检测结果比较(%)

注a：PCR-反向斑点杂交法检测NTM阳性183例，以最终确诊情况为金标准，确认假阳性3例；敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；诊断NTM肺病阳性预测值=NTM真阳性例数/(NTM真阳性例数+NTM假阳性例数) ×100%；诊断结核病阳性预测值=结核病真阳性例数/(结核病真阳性例数+结核病假阳性例数) ×100%

表4 2种检测方法在两组患者中的阳性检测结果对比(例)

注a：包括3例假阳性

讨 论

近年来，NTM病的发病率无论在欧美国家还是亚洲国家均逐年上升。根据2010年全国结核病流行病学抽样调查资料，NTM分离率2000年为11.1%，2010年上升至22.9%[8]。NTM病诊断困难，高度耐药，并且复发率高，对其进行早期诊断是对NTM病进行规范化治疗的前提[9]。以生化试验为主的分枝杆菌菌种鉴定技术由于操作复杂，耗时而结果不准确，因此已不常使用[10]。近年来，以免疫层析技术为基础的MPB64抗原胶体金法，以色谱技术为基础的气相及高效液相色谱法，以基因探针、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)及PCR-基因测序方法为代表的分子生物学技术的引入，为NTM病的菌种鉴定提供了更为科学的方法[11]。

NTM和结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属，致病机制类似。两者导致机体发病的临床症状和体征具有较高的相似性[12]，临床易将NTM肺病误诊为肺结核[3]。PCR-反向斑点杂交法简单易行，可同时检测MTBC和NTM，且PCR-反向斑点杂交法可于1个工作日获得检测结果，分枝杆菌培养需4周获得培养结果。PCR-反向斑点杂交法应用于分枝杆菌的鉴定由来已久，现有报道主要应用于大样本量的结核分枝杆菌和小样本量的NTM的研究[13-14]，大样本量NTM的研究结果少见。

NTM肺病胸部CT检查可见支气管扩张、空洞(尤其是薄壁空洞)影、结节影、斑片状影及小斑片样实变影、树芽征、线状及纤维条索状影等表现，且通常以多种形态病变混杂存在[2]。本研究以胸部CT检查为基础，选取临床疑诊为NTM肺病的334例患者，分别取痰液行PCR-反向斑点杂交法和培养法检测并进行比较，探讨PCR-反向斑点杂交法对NTM肺病的诊断价值。通过研究发现2种检测方法对分枝杆菌的检出率分别为64.67%和67.66%，差异无统计学意义。在NTM组，PCR-反向斑点杂交法敏感度为82.57%；在结核病组，PCR反向斑点杂交法特异度为78.57%。笔者认为，以胸部CT检查为诊断依据的患者中，应用PCR-反向斑点杂交法行痰液NTM检测具有较高的敏感度和特异度，且检测方法简便、快速，能直接进行菌种鉴定，对指导临床医生快速准确诊断和及时治疗有一定的参考意义。

张洁等[13]对1552株涂片抗酸染色阳性的临床分离株，分别进行PNB-TCH生长试验和PCR-探针法检测。结果显示：2种检测方法检出NTM的符合率为75.4%，MTBC的符合率为99.0%，总体符合率为99.0%。本研究分析两组患者检测结果，PCR-反向斑点杂交法与最终确诊结果相比，总体诊断符合率为83.08%；传统培养法与最终确诊结果相比，总体诊断符合率为86.92%。此外，张洁等[13]研究显示，部分NTM使用PNB-TCH生长试验进行鉴定时会出现误差，其中主要涉及堪萨斯分枝杆菌，而PCR-探针法鉴定MTBC和NTM的准确性较高。本研究中PCR-反向斑点杂交法、培养法与最终确诊结果符合率均较高，但与张洁等[13]研究结果尚有一定差距，本研究检测方法假阴性率略高。

进一步分析经反向斑点杂交法鉴定为NTM的183例患者的NTM菌种：胞内分枝杆菌89例，脓肿分枝杆菌39例，鸟分枝杆菌19例，草分枝杆菌11例，龟分枝杆菌10例，堪萨斯分枝杆菌8例，瘰疬分枝杆菌3例，偶发分枝杆菌2例，次要分枝杆菌2例。与文献报道的NTM种属分布的地域特点相符[14]，但与广州等NTM病高发地区的NTM主要菌种分布构成比有明显不同[15]，广州当地的NTM菌种分布构成比前3位分别为龟-脓肿分枝杆菌复合群(43.18%)、鸟-胞内分枝杆菌复合群(18.24%)、戈登分枝杆菌(8.53%)，其后依次为偶然分枝杆菌(6.96%)、瘰疬分枝杆菌(4.33%)、堪萨斯分枝杆菌(3.67%)、耻垢分枝杆菌(3.15%)和不产色分枝杆菌(2.62%)、苏尔加分枝杆菌(1.57%)、猿分枝杆菌(1.57%)、玛尔摩分枝杆菌(1.57%)。本研究中，PCR-反向斑点杂交法在NTM肺病组中假阴性35例，考虑可能的原因为：(1)确诊患者中检测标本包括痰液、灌洗液及病理活检组织等，而研究方法中的标本仅取患者痰液，标本信息不完全导致假阴性率增高；(2)多种因素可以影响PCR扩增效率，如DNA提取效率、扩增抑制物的存在等，均可导致假阴性；(3)本研究所选患者的痰涂片阳性率低，只有61.68%，不除外患者取痰方法不当导致痰液标本阳性率低；(4)当痰标本中所含菌量较少时，存在检测假阴性的可能；(5)对NTM与MTBC混合感染的菌株检测结果有误差，于霞等[16]报道，分枝杆菌鉴定试剂盒(分子杂交法)对堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌与H37Rv的混合感染鉴定结果不佳；孔冬青[17]曾报道，煤工尘肺且存在并发免疫功能低下的疾病和因素的患者，临床中痰标本检测发现了NTM并发MTBC；本研究剔除了结果明确的NTM和MTBC混合感染，但仍不能完全排除未经现有检查结果证实的混合感染；(6)当靶序列存在个别碱基与探针错配时仍可以发生杂交，因此存在个别碱基差异的核苷酸序列不容易区分[18]，导致产生误差。

近年来，有研究也报道针对不同靶基因建立多重PCR法进行检测，鉴定MTBC和NTM，敏感度和特异度更高[19]。笔者认为，应用多重PCR法进行MTBC与NTM的快速检测是今后的研究方向之一。

由于NTM是一类在环境中广泛存在的细菌，单次阳性并不能完全排除污染的可能，此外也必须考虑呼吸道可能存在NTM定植等因素。临床医生判断时，仍需结合细菌学依据、患者临床表现和胸部影像学资料等多种因素进行综合考虑。