基于化学模式识别技术的不同产地土炒白术质量比较研究△

王小平，杨丽珠，夏玉苹，陈育青，王琼珺，谢伟容

(1.漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000；2.江西中医药高等专科学校，江西 抚州 344000)

白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的根茎，具健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之功能[1]。白术最早载于《神农本草经》，作为土炒炮制法代表药物之一，土炒白术在历代医书中多有记载，如《本草蒙筌》“陈壁土制，窃真气骤补中焦”[2-3]。清代名医傅山在《傅青主女科·女科卷》收录80首方中，使用白术的方剂有48首，其中白术土炒就占有45首[4]。据现代研究，土炒辅料可协同增强白术的健脾止泻作用，并实验证明土炒白术组方的参苓白术散对降低脾虚小鼠的腹泻指数及提高脾虚小鼠的脾虚指数的作用强于麸炒白术[5-6]。但由于炮制辅料土来源复杂，各地土炒工艺及评价标准不统一，土炒白术饮片质量良莠不齐，影响临床安全有效用药。因此，为考察市场上土炒白术饮片质量情况，本实验收集了全国不同产地的10批白术土炒品，研究比较其中所含化学成分差异，为其质量评价及临床安全用药提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国)；METTLER-TOLEDO AB265-S型电子分析天平(瑞士)；FST-Ⅲ-10 精密型超纯水机(上海富诗特)；OHAUS AR2140电子分析天平(上海)；KQ5200超声波清洗器(昆山)。

1.2 材料

土炒白术炮制品，购自福建、江西、安徽、四川等全国不同地区，经本院中药教研室陈育青副教授鉴定为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎的土炒加工品，样品详细信息见表1；白术内酯Ⅰ(批号：MUST-17030201)、白术内酯Ⅱ(批号：MUST-17030202)、白术内酯Ⅲ(批号：MUST-17030203)，购自成都曼斯特生物科技有限公司，含量≥99%；中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A，国家药典委员会)；试剂除HPLC用乙腈为色谱纯外，其他均为分析纯。

表1 不同产地土炒白术样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～20 min：45% A→70% A；20～40 min：70% A→85% A；40～50 min：85% A→55%A)；50～60 min：55% A→45% A)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：242 nm；柱温：30 ℃。

2.2 试液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ各适量，加甲醇制成每1 mL分别含65.10、83.20、60.15 μg的混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取土炒白术样品适量，粉碎过60目，精密称取2 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，精密称重，超声提取(功率200 W，频率40 kHz)45 min，取出，再称重，补足减失重量，取上清液，临用前用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 测定法

分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录60 min色谱图，结果见图1。

注：a.白术内酯Ⅲ；b.白术内酯Ⅱ；c.白术内酯Ⅰ；R.参照物；S.白术土炒品。图1 白术土炒品HPLC指纹图谱

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液(土炒白术样品S1)注入高效液相色谱仪，按照2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，将图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，结果各样品相似度均大于0.99，RSD为0.28%。各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的RSD值分别在0.06%～0.25%和0.37%～0.62%之间，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取土炒白术样品S1共6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别进样，记录色谱图，将图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，结果各样品相似度均大于0.98，RSD为0.60%。各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的RSD值分别在0.08%～0.49%和0.59%～1.81%之间，表明该分析方法重现性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液(土炒白术样品S1)，按照2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、24 h进样，记录色谱图并积分，将图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理，结果各样品相似度均大于0.98，RSD为0.74%。各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的RSD值分别在0.07%～0.60%和0.51%～1.16%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 土炒白术HPLC指纹图谱的建立

2.5.1 土炒白术HPLC指纹图谱采集 分别取10批不同土炒白术样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定，记录10批样品HPLC 色谱图，将其导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，得土炒白术累加图谱，见图2。

2.5.2 指纹图谱共有峰的标定 以中位数法生成对照指纹图谱，设定时间窗宽度为0.30 min，软件自动匹配图谱，将10批次土炒白术样品图谱都匹配的色谱峰标定为共有指纹图谱峰。结果本研究共标定有13个共有指纹峰，同时建立对照指纹图谱，见图3。根据参照物色谱峰，可知7号为白术内酯Ⅱ峰，其在指纹图谱中保留时间及峰面积适当，故选用其(S号峰)作为参照峰，见图3。

2.5.3 相似度评价 以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算不同土炒白术样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2、表3。依指纹图谱相似度软件计算10批不同土炒白术样品HPLC 指纹图谱相似度，见表4。

注：S1～S10.10批不同土炒白术；R.对照图谱。图2 土炒白术样品叠加谱及对照指纹谱

注：峰3.白术内酯Ⅲ；峰7.白术内酯Ⅱ；峰10.白术内酯Ⅰ。图3 10批土炒白术样品HPLC指纹图谱共有峰

表2 不同产地白术土炒品共有峰相对保留时间

表3 不同产地白术土炒品共有峰相对峰面积

表4 不同产地白术土炒品HPLC指纹图谱相似度计算结果

注：S对*为对照指纹图谱。

由表4可知，不同产地白术土炒品之间的指纹图谱相似度值存在差异性。与对照指纹图谱相比较，江西樟树(S2)、河北安国(S3)、福建漳州(S4)、福建漳州(S5)、浙江磐安(S8)、四川乐山(S9)、安徽亳州(S10)等土炒品相似度值均在0.85以上，而广东普宁(S1)、福建漳州(S6)、江苏苏州(S7)等相似度值均在0.6以下。

2.6 系统聚类分析(HCA)

将各色谱峰面积相对于称样量量化，利用SPSS 19.0分析软件对样品进行系统聚类分析，采用组间平均数联接法，以平方欧氏距离作为样品相似度的距离公式。结果10个样品基本可分为3大类(见图4)，S3、S4、S5、S8、S9聚为第1类，S1、S6、S7聚为第2类，S2、S10聚为第3类。

图4 不同产地白术土炒炮制品聚类谱系图

2.7 样品主成分分析(PCA)

分别将10批样品各色谱峰峰面积输入Excel 表格内，得到批数×色谱峰数的数据矩阵，导入SIMCA-P 14.1软件中进行PCA分析(见图5)。结果发现10 批样品基本可分为3 组，样品S1、S6、S7 为1类，S2、S10 为1类，S3、S4、S5、S8、S9为1类，与系统聚类分析结果一致。

图5 不同产地白术土炒炮制品主成分分析得分散点图

2.8 偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)

为确定各样品组间差异性，采用PLS-DA模式识别方法，筛选出组间成分差异贡献率较大的共有峰。分别将10批样品共有峰峰面积输入Excel 表格内，得到批数×共有色谱峰数(10×13)的数据矩阵，导入SIMCA-P 14.1软件中进行PLS-DA模型拟合，并分析生成差异性标记物的变量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)图(见图6)，其中VIP>1的成分有5个，影响大小依次为峰5、峰7(白术内酯Ⅱ)、峰10(白术内酯Ⅰ)、峰3(白术内酯Ⅲ)、峰11，表明这些成分是不同产地白术土炒品之间成分差异的主要标记物，对其质量差异的影响较大。

图6 不同产地白术土炒品差异性变量VIP图

3 讨论

本实验对不同提取溶剂(甲醇、50%甲醇)、不同提取时间(30 、45、60 min)和超声(功率200 W，频率40 kHz)、回流两种提取方法进行比较，结果表明甲醇超声45 min 提取的供试品溶液色谱峰数多，组分含量高。

由实验结果分析，不同产地土炒白术样品内含化学成分的存有差异，而其药效成分白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ等又是成分差异主要标记物，影响其临床组方药效。因此，为提高中药饮片的安全性、有效性，应增加土炒白术中白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ等内酯类成分的含量控制。

土是固体炮制辅料中最特殊的一类，其不仅作为传热体，而且通过在中药饮片表面“挂土色”而与饮片一起入药，是最能体现传统“药辅合一”的制药理念。《黄帝内经》：“土者脾也，生万物而法天地。”《本草纲目》：“土者，五行之主，……，在人则脾胃应之，故诸土入药，皆取其裨助戊已之功。”《景岳全书》“炒以壁土，欲助其固。”目前，辅料土可选用伏龙肝、壁土、黄土、红土、白土、红砖粉、赤石脂等[4,7-8]，性质效用不一，是导致土炒白术质量差异大的主要原因。根据土炒炮制目的，伏龙肝是最符合传统炮制意图的辅料。因此，加强土炒炮制辅料研究，是传承中药特色土炒炮制方法亟待解决的课题。