响应面法优化黄芪茎叶总黄酮提取工艺及其抗炎活性研究△

黄文静，孙晓春，周瑞，张严磊，谢培，李铂，王二欢，唐志书*

(1. 陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2. 陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710077)

黄芪是豆科黄芪属植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranceus(Fisch.)Bge.的干燥根，为我国常用大宗药材[1]。传统医学认为，黄芪具有补气固表，敛疮生肌，利尿托毒等功效[2-3]，在归脾丸、降糖丸、参茸白凤丸、龟鹿补肾丸、补中益气丸、产复康颗粒等经典组方中均有黄芪，其应用十分广泛[1]。现代医学研究认为黄芪有效成分具有强心降压、保护血管、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖等功能[4]。据报道，黄芪药材主要活性成分为黄酮类物质，具有显著的促进细胞增殖和抗氧化等活性[5]。目前已从黄芪药材中分离出30多种黄酮类物质，包括芒柄花素、毛蕊异黄酮和红车轴草异黄酮等[6]。

我国内蒙古、山西、甘肃、青海和陕西北部均有种植黄芪的传统，其产区分布十分广泛，由于市场对黄芪的需求量逐年增加，种植规模还在不断扩大[7]。通过前期研究发现，黄芪茎叶中含有大量的黄酮类化合物，但每年药材采挖后地上茎叶往往丢弃，因此造成巨大的浪费。本研究在前期实验的基础上，通过响应面法优化黄芪茎叶总黄酮提取工艺，同时对其进行抗炎活性分析，以期为黄芪茎叶黄酮类物质的开发和深层次利用提供理论依据。

1 材料与仪器

本实验用黄芪经陕西中医药大学王继涛研究员鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜荚黄芪Astragalusmembranceus(Fisch.)Bge.混交种，其地上部分茎叶于9月上旬采自甘肃省陇南市宕昌县阿坞乡麻界村黄芪种植基地。将割取的黄芪茎叶置于阴凉处晾干，粉碎机粉碎后装于塑料袋中避光密封保存。

95%乙醇、无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠和Tris等化学试剂购于陕西乐博生化试剂有限公司，均为分析纯；芦丁标准品购于陕西标普医药科技有限公司；96孔细胞培样板(Corning 公司)，DMEM培养基(Gibco 公司)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)为美国 Sigma 公司产品，Griess 试剂购自北京华奥正生公司，小鼠巨噬细胞系RAW264.7购于中国科学院上海细胞库。

高速粉碎机(广州美的)、UV-2600紫外分光光度计(日本岛津)、HH-8数显恒温水浴锅(上海一恒)、电子天平(北京赛多利斯)、电热鼓风干燥箱(上海博讯)、RE-200A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器)、超声波仪(昆山超声仪器有限公司)、CO培养箱(赛默飞世尔)、SW-CJ-10洁净工作台(苏州安泰)、Infinite M200 PRO酶标仪。

2 方法

2.1 总黄酮含量测定

总黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[8]。以芦丁作为对照品，于510 nm 处测定不同浓度芦丁溶液的吸光值，以吸光度值(Y)为纵坐标、芦丁浓度(X)为横坐标绘制芦丁标准曲线，得线性回归方程为：Y=9.322 9X-0.003 9(r=0.998 8)。

称取干燥黄芪茎叶粉末20 g，用醇提法进行提取。将醇提物烘干后加入50 mL 无水乙醇溶解，以无水乙醇为空白，取1 mL 醇溶液在510 nm处测定吸光度值，根据芦丁标准曲线计算总黄酮含量。

样品提取率(%)=0.0025X×100%

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2.2 总黄酮提取工艺

黄芪茎叶总黄酮提取的工艺流程。样品粉碎→过40目筛→称重→加入乙醇→超声提取30 min→回流提取90 min→抽滤→减压浓缩→烘箱烘干→提取物浸膏。

2.3 单因素试验

在固定乙醇体积分数为60%、液料比15∶1、提取温度为60 ℃、超声功率为100 W的条件下，分别考察乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、提取温度(50、60、70、80、90 ℃)、超声功率(50、100、150、200、250 W)对黄芪茎叶总黄酮得率的影响。

2.4 黄芪茎叶总黄酮提取工艺优化

在单因素试验的基础上，利用响应面分析法进行提取工艺条件的优化[9-10]。选取乙醇浓度、液料比、提取温度、超声功率4个因素为自变量，以总黄酮得率为响应值，进行四因素三水平实验设计，试验因素水平如表1所示。

表1 响应面分析因素与水平

2.5 黄芪茎叶总黄酮体外抗炎性评价

黄芪茎叶总黄酮体外毒性试验采用MTT法，以提取物处理下巨噬细胞RAW264.7的细胞存活率表示毒性大小。按照赵灿等[11]的方法，采用经典的Griess 试剂来检测亚硝酸盐，从而测定出总NO 浓度。取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7，以地塞米松为对照药品使用LPS诱导其产生NO，于酶标仪上测定550 nm处吸光值，根据标准曲线求出各处理NO浓度，计算NO抑制率[12]。

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2.6 数据处理

各指标测定的数据用Excel处理作图，采用Design-Expert 8.0软件处理得响应面分析结果。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 乙醇浓度对黄芪茎叶总黄酮得率的影响 如图1所示，随着乙醇浓度的增加黄芪茎叶总黄酮得率逐渐增高，当乙醇浓度大于70%时黄酮得率保持在3.3%左右，远高于50%和60%乙醇浓度下的总黄酮得率，乙醇浓度为90%时总黄酮得率最高为3.49%。

图1 乙醇浓度对黄芪茎叶总黄酮得率的影响

3.1.2 液料比对黄芪茎叶总黄酮得率的影响 如图2所示，黄芪茎叶总黄酮得率随着乙醇用量的增加呈先增高后降低的趋势，液料比为15∶1时黄酮得率最大为2.96%，而液料比30∶1时总黄酮得率仅为2.35%，由此可见高乙醇用量并不能使总黄酮得率增加，从降低成本考虑后续试验选择液料比为15∶1最为适宜。

图2 液料比对黄芪茎叶总黄酮得率的影响

3.1.3 温度对黄芪茎叶总黄酮得率的影响 由图3可知，当提取温度在60～70 ℃之间时总黄酮得率最高，较低温度下(50 ℃)总黄酮的得率仅为2.78%，温度过高(>80 ℃)也不利于总黄酮的提取，这有可能是黄酮在高温下的性质不稳定所致。

图3 温度对黄芪茎叶总黄酮得率的影响

3.1.4 超声功率对黄芪茎叶总黄酮得率的影响 由图4可知，在所试验的超声功率范围内，总黄酮得率与超声功率呈正相关关系，超声功率越大黄酮得率越高，超声功率50W时总黄酮得率仅为2.26%，而超声功率200W时总黄酮得率高达3.35%。

图4 超声功率对黄芪茎叶总黄酮得率的影响

3.2 黄芪茎叶总黄酮提取工艺条件的优化

根据单因素试验的结果，按表1所示的因素和水平采用响应面法设计进行后续试验。

3.2.1 回归模型的建立与检验 采用Design-Expert 8.0软件处理表2数据，进行多元回归拟合后得到总黄酮得率(Y)与乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)和超声功率(D)的回归方程：Y=8.65-0.11A+0.34B+0.26C-0.28D+0.15BA-0.05AC-0.17AD+0.81BC+ 0.12BD+0.085CD-1.64A2-1.84B2-1.33C2-2.80D2。该方程中各一次项系数的绝对值和正负值分别代表该因素对响应值影响的大小和方向，各因素按影响大小排序依次为B>D>C>A，液料比对黄酮得率影响最大，乙醇浓度的影响最小。该方程的二次项系数为负值，推断方程响应面的开口向下，具有极值点，对该方程进行方差分析结果见表3。

表2 响应面分析方案和试验结果

表3 回归模型方差分析

3.2.2 响应面交互分析 通过固定四个因素其中的两个因素为零水平，可绘制响应面和等高线，直观地考察其他两因素的交互效应对总黄酮得率的影响[13-14]。在所得响应面图中，曲面越陡峭，则该因素对总黄酮得率的影响越显著；等高线图与响应面图相对应，等高线图形状越接近椭圆形，表明两个因素间的交互作用越强[15]。由图5～10可以看出，提取温度和乙醇浓度的响应曲面较为平缓，表明其交互作用较弱(图6)；液料比和乙醇浓度、超声功率和乙醇浓度、提取温度和液料比、超声功率和液料比、超声功率和提取温度的响应曲面(图5、图7～10)均较为陡峭，表明这些因素之间的交互作用较强；图7、图9和10图的等高线图最接近于椭圆形，说明超声功率和乙醇浓度、液料比以及提取温度之间的交互作用最强。由此可见，在黄芪茎叶总黄酮的提取过程中，除提取温度和乙醇浓度之外，不同因素之间的相互影响较强，对总黄酮的得率存在着一定的协同作用，其中尤其要考虑到超声功率的影响。

3.2.3 最佳条件优化及验证 通过对3.2.1所得的回归方程分析，所得黄芪茎叶总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度79.71%，液料比15.59∶1，提取温度71.32 ℃，超声功率197.77 W，在此工艺条件下所得的总黄酮的理论值为8.69%。为验证此条件的准确性，本着节约成本和试验操作的便利，将上述条件修正为乙醇浓度80%、液料比15∶1、温度70 ℃、超声功率200 W，在此条件下，重复实验3次，总黄酮得率为8.58%，表明该优化后的工艺参数能很好地提取黄芪茎叶总黄酮。

图5 液料比和乙醇浓度响应曲面

图6 提取温度和乙醇浓度响应曲面

图7 超声功率和乙醇浓度响应曲面

图8 提取温度和液料比响应曲面

图9 超声功率和液料比响应曲面

图10 超声功率和提取温度响应曲面

3.3 黄芪茎叶总黄酮的抗炎活性

3.3.1 细胞毒性 采用MTT法测定了黄芪茎叶总黄酮对RAW264.7细胞存活率的影响，如图11所示，总黄酮浓度在1～50 μg·mL-1范围内对RAW264.7细胞存活率的影响无显著差异，说明在此浓度范围内黄芪茎叶总黄酮对细胞无毒性。当总黄酮浓度达100 μg·mL-1时细胞存活率显著下降，说明在此高浓度下，总黄酮对细胞产生毒害。

注：*.代表与对照组差异显著( P<0.05)。图11 不同浓度总黄酮处理对细胞存活率的影响

3.3.2 抗炎活性 如图12所示，正常状态下RAW264.7细胞的NO释放量在5 μmol·L-1左右，加入黄芪茎叶总黄酮后，NO的释放受到明显抑制。总黄酮浓度在1～50 μg·mL-1时，NO释放量与对照组差异达极显著水平；随着黄酮添加浓度的增加，NO的释放量不断升高，当处理浓度为100 μg·mL-1时，NO释放量升高至4.52 μmol·L-1，这可能是高浓度的总黄酮产生了一定的细胞毒性所致。

注：**. 代表与对照组差异极显著( P<0.01)；*.代表与对照组差异显著( P<0.05)。图12 不同浓度总黄酮处理对NO释放量的影响

如图13所示，LPS能够极显著的诱导RAW264.7细胞NO增加，LSP处理后NO的释放量由4.89 μmol·L-1上升至21.89 μmol·L-1，增加约4倍。黄芪茎叶总黄酮的加入除能够降低细胞本底NO水平外(图12)，还显著地抑制了由LPS所引起的NO释放量的增加，随着总黄酮浓度的增加细胞NO浓度不断降低，存在明显的剂量效应。在LPS诱导下向RAW264.7细胞加入100 μg·mL-1总黄酮和加入对照药品20 μg·mL-1地塞米松所产生的NO释放量差异不显著，说明黄芪茎叶总黄酮有较为明显的抗炎活性。

图13 LPS诱导与不同处理对NO释放量的影响

4 结论与讨论

本研究通过响应面法分析得到黄芪茎叶总黄酮提取的最佳工艺：乙醇浓度80%，液料比15∶1，提取温度70 ℃，超声功率200 W，在此技术参数下总黄酮得率为8.58%。超声功率与乙醇浓度、液料比和提取温度等因素之间的交互影响很强，与前期未经超声波处理的黄芪茎叶相比(另文发表)，经过超声处理后的黄芪茎叶通过醇提，其总黄酮的含量上升一倍左右，因此在实际生产中应当重视超声处理的作用。本研究所得的实验模型具有较好的预测性，实验重复性好，可为黄芪茎叶总黄酮的工业化提取提供一定的理论支持。

NO是一种常见的炎性介质，过量的NO可导致一系列炎症疾病的发生[16]。本研究发现，一定浓度范围内的黄芪茎叶总黄酮(1～50 μg·mL-1)对RAW264.7细胞无明显毒性，除能够减少RAW264.7细胞本底NO的生成外，还可有效抑制由LPS所诱导的NO浓度急剧上升，由此说明，黄芪茎叶总黄酮具有一定的抗炎活性。