HPLC同时测定黑老虎中3个木脂素类化合物的含量

2018-07-31 10:22杨能英何风雷彭富全陈明权农根林
中国现代中药 2018年7期
关键词:防城港五味子乙酰

杨能英,何风雷,彭富全,陈明权,农根林

(广州白云山陈李济药厂有限公司,广东 广州 510288)

黑老虎为五味子科南五味子属植物冷饭团Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根,别名过山龙、大钻、臭饭团、钻地风等,主要分布于我国江西、湖南、福建、广西、四川、云南等地。味辛、微苦,性温,具有行气活血、祛风止痛的功能,主要用于治疗风湿痹痛、痛经、脘腹疼痛、跌打损伤等[1-2]。在民间黑老虎常用于治疗胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、急性胃肠炎、风湿性关节炎、痛经、产后瘀血腹痛等症[3]。黑老虎的主要生理活性成分为木脂素和三萜酸[4]。其中木脂素结构类型较多,立体化学复杂,而且具有抗肝炎、抗艾滋病毒和抗肿瘤等活性[5-6]。黑老虎药材标准收载于《广东省中药材标准》2004年版(第一册),标准中没有含量测定项。本实验对黑老虎中3个木脂素类化合物的含量测定方法进行了研究,为黑老虎药材质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪,Sartorious(CP225D)十万分之一天平,Sartorious(BS110S)万分之一天平。SB-5200DT超声波清洗机(300 W,40 Hz)。色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 试药

日本南五味子素甲(纯度为98.2%)、乙酰日本南五味子素甲(纯度为97.5%)和(2′S)-南五味子木脂素J(纯度为98.7%)对照品,均为自制,由中国科学院华南植物园魏孝义研究员进行结构解析,鉴定[7-9]。

黑老虎药材防城港1、防城港2、防城港3采挖于广西防城港,还有采挖于福建武平、广东梅州等地的样品各1批,其余7批黑老虎药材购于广西玉林中药材市场,产地越南,批号分别为1607002、1610001、1704001、1705001、1610002、1703001、1703002,编号为越南1、越南2、越南3、越南4、越南5、越南6、越南7,由广东药科大学李钟副教授鉴定为五味子科南五味子属植物冷饭团Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根。

乙腈、甲醇为色谱纯;水为Millipore去离子水;磷酸、乙醇等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈为流动相A,甲醇为流动相B,0.1%磷酸-水为流动相C,梯度洗脱(0→5 min,35%→40%A,5%→10%B,60%→50%C;5→30 min,40%→45%A,10%→15%B,50%→40%C;30→65 min,45%→80%A,15%→5%B,40%→15%C);检测波长为214 nm;流速为1 mL·min-1;柱温为30 ℃。HPLC图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量,分别置于3个50 mL量瓶中,用乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品贮备液。各成分对照品溶液的质量浓度分别为日本南五味子素甲0.177 8 mg·mL-1、乙酰日本南五味子素甲0.164 6 mg·mL-1、(2′S)-南五味子木脂素J 0.191 8 mg·mL-1。分别量取10、10、20 mL,置于同一50 mL量瓶中,用乙醇稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品(日本南五味子素甲35.56 μg·mL-1、乙酰日本南五味子素甲32.92 μg·mL-1、(2′S)-南五味子木脂素J 76.72 μg·mL-1)。

注:A.混合对照品;B供试品;1.日本南五味子素甲;2.乙酰日本南五味子素甲;3.(2′S)-南五味子木脂素J。图1 黑老虎药材及对照品HPLC图

2.3 供试品溶液的制备

精密称取黑老虎药材细粉(过四号筛)0.5 g,置100 mL具塞锥形瓶中,精密加入乙醇50 mL,称定质量,超声提取30 min,取出,放冷,再次称定质量,用乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中,分别用乙醇稀释至刻度,每个质量浓度取10 μL注入高效液相色谱仪,依法测定,以对照品的进样量X(ng)为横坐标,以峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,得线性回归方程,结果见表1,可以看出各成分在各自进样量范围内线性关系良好。

表1 3个木脂素成分的线性关系考察

2.5 精密度试验

取同一批号黑老虎药材(批号:1610002),按2.3项下方法制备供试品溶液,连续进样6针,依法测定,结果日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的峰面积RSD分别为1.02%、0.86%、1.35%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号黑老虎药材(批号:1610002),6份,每份约0.5 g,精密称定,按2.3项下方法制备供试品溶液,依法测定,测得日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量RSD分别为1.85%、2.23%、1.52%(n=6),结果表明该方法具有良好的重复性。

2.7 稳定性试验

取同一批号黑老虎药材(批号:1610002),按2.3项下制备供试品溶液,分别在0、3、6、9、12、24 h依次进样,依法测定,日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的平均峰面积分别为892.6、513.2、1475.7,RSD分别为0.98%、1.94%、2.05%(n=6)。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批号黑老虎药材(批号:1610002)6份,每份约0.25 g,精密称定,每份中分别加入对照品溶液:日本南五味子素甲(0.177 8 mg·mL-1)2 mL、乙酰日本南五味子素甲(0.164 6 mg·mL-1)1.5 mL、(2′S)-南五味子木脂素J(0.191 8 mg·mL-1)4 mL,按2.3项下方法制备供试品溶液,依法测定,计算回收率,结果见表2。

2.9 黑老虎药材含量测定

2.9.1 黑老虎药材含量测定 取黑老虎药材10批,分别为广西防城港采挖的3个样品(防城港1,防城港2,防城港3)和产于越南的7批样品,按2.3项下方法制备供试品溶液,依法测定,计算供试品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量,结果见表3。

表2 黑老虎中3个木脂素类成分回收率试验结果

表3 10批黑老虎药材中3个木脂素成分含量测定 %

2.9.2 黑老虎药材皮部、木部含量测定 取广西防城港3个样品和越南进口4批样品,将皮部和木部分离,粉碎,取细粉(过四号筛)按2.3项下方法制备供试品溶液,依法测定,计算供试品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量,结果见表4。

3 讨论

本实验采用甲醇、乙醇、70%甲醇水、70%乙醇水、稀乙醇作为提取溶剂,采用超声提取,提取效果没有显著差异,因此,选用无毒的乙醇作为提取溶剂。考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水等流动相的等度和梯度洗脱,通过比较3个成分的峰形、分离度及保留时间,综合考虑,最终选择了文中甲醇-乙腈-0.1%磷酸水系统,采用梯度洗脱,可以得到比较理想的色谱峰。

从10批药材含量测定结果可以看出,日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、和(2′S)-南五味子木脂素J的质量分数分别在0.021 9%~0.159 5%、0.031 8%~0.176 7%和0.036 4%~0.702 8%,3个成分中(2′S)-南五味子木脂素J含量相对较高。对于黑老虎药材的指标成分含量测定还需要收集更多的样品,确定指标成分的含量限度。

黑老虎药材的木部和皮部很容易分离,对同一样品的皮部和木部分离后,分别取其细粉,进行3个木脂素的含量测定,发现皮部和木部均含有这3个成分,但在皮部和木部中的含量并不一样,差异较大。7批样品中,日本南五味子素甲在皮部和木部的含量比最大为1∶5.8,乙酰日本南五味子素甲在皮部和木部的含量比最大为1∶3.4;(2′S)-南五味子木脂素J在皮部和木部的含量比最大为1∶34.3,且在木部中含量较高,可以看出(2′S)-南五味子木脂素J在皮部和木部的含量差异最大。皮部和木部的含量差异可能与采挖季节和生长年限有关。

(2′S)-南五味子木脂素J在体外药效实验证明,对肝癌细胞增殖具有较好的抑制作用[10],该成分在黑老虎药材中含量相对较高,特别是在木部中含量更高,提示提取该活性成分可以考虑从木部提取或者采用木部入药。

通过对福建武平、广东梅州、广西防城港、越南等地的黑老虎样品进行检测,比较不同产地黑老虎样品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、和(2′S)-南五味子木脂素J的的含量,发现福建武平、广东梅州含量很低,广西防城港的样品含量相对较高,而越南进口的黑老虎样品含量更高,说明黑老虎药材中所含成分地域差异性较大。

表4 黑老虎药材皮部和木部含量测定

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