干旱胁迫下ALA对羊草生长、内源激素及转录组的影响

宋吉轩，吕俊，宗学凤，何秀娟，徐宇，吴潇，王三根*

(1.西南大学农学与生物科技学院，重庆400715；2.贵州省农业科学院生物技术研究所，贵州 贵阳 550006)

由于气候的变化，干旱对植物的影响在全球范围内日益严重，其不仅造成土壤水分缺失，还可导致极端现象发生，因干旱引起的植物生长发育和作物产量的减产超过了其他环境胁迫的总和[1]。故干旱胁迫对植物的生长、代谢等的影响研究已成为研究的热点[2]。羊草(Leymuschinensis)具有高产、优质及耐牧等特点，是我国多地优势的禾本科多年生牧草作物和生态草[3]。同样，我国羊草分布区也受到干旱等环境胁迫，对其生产力的提高有很大影响[4]。

羊草虽然具有一定的耐旱能力，但当其生境严重缺水时，其生长发育、产量及质量也会受到严重的影响[4-5]。干旱胁迫使植物体内发生一系列的生理生化反应和基因表达的变化[6]，利用外源物质对植物进行处理，是提高植物抗逆性简便、可行的方法之一[7]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一种包含氧和氮的碳氢化合物，是生物体内的叶绿素、血红素和维生素B12等合成的前体物质，广泛存在于动植物和微生物的细胞中[8]。ALA对人畜无害，同时对环境无污染易降解，具有类似于植物激素的生理活性，被作为一种新型的植物生长调节剂，可促进生长，增强光合效率，加强植物组织的分化及物质转运等[9]。ALA也具有提高植物抗逆性的功能如遮阴胁迫[10]，低温胁迫[11]，干旱胁迫[12]等。ALA可以提高羊草在盐胁迫[13]与温度胁迫[14]下的抗性，促进生长。也对ALA提高羊草抗旱力作了初步报告[5]。

转录组是从基因功能和结构整体水平出发，揭示特定生物过程的分子机制[15]。植物体的抗旱是由多基因控制的[16]，涉及一系列的调控及很多基因的表达。转录组测序为研究植物抗性机理提供了方便，成为揭示干旱胁迫信号通路和预测基因功能的有力工具[17]。关于羊草抗性的研究主要集中在生理生化方面，在转录组方面的研究很少。孙业鹏[18]通过转录组分析对盐碱胁迫下羊草与盐碱胁迫相关的功能关系进行研究。董圆圆等[19]对盐碱胁迫下羊草转录因子进行了分析。尚未见干旱胁迫特别是ALA处理后羊草转录组分析的报告。

由于植物对干旱胁迫的响应是通过分子、细胞和植物层面利用一系列生理生化反应来综合调控的[20]，本研究试图将植株生长、物质积累、根系活力、氮磷钾含量及其相关酶活性的改变、内源激素的含量及其比例变化、转录组水平相关变化联系起来，解析干旱胁迫与ALA处理对羊草生长的影响机制，为在生产实践中利用ALA调控羊草生长提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验所用的羊草种子采集于锡林浩特的中国农业科学院草原研究所退化恢复样地，试验于2016年4月开始于西南大学进行。选取籽粒饱满、大小一致和无病虫害的羊草种子，用浓度为1.0% 次氯酸钠溶液进行消毒处理10 min左右，然后用蒸馏水冲洗3～5次，将种子均匀铺入有双层滤纸的培养盘中进行种子发芽试验。种子在培养箱中 (25±1) ℃恒温培养，光照时间设为14 h/10 h(昼/夜)，光照强度为2500 lx。1周后将长势一致的羊草幼苗移栽到盆钵里，利用称重法每天监测土壤的水分含量，并及时补充各处理消耗的水分[21]。参考Hsiao[22]对植物水分胁迫的等级划分以及其他有关羊草干旱胁迫的相关研究[23-25]，以土壤相对含水量80% 为对照1(CK1)，土壤相对含水量50% 作干旱胁迫为对照2(CK2)，并设干旱胁迫+ALA浓度分别为10 mg·L-1(T10)、50 mg·L-1(T50)和100 mg·L-1(T100)3个处理。当羊草株高为18～21 cm时，对各处理进行不同浓度ALA叶面喷施，对照则喷施等量的清水；7 d 后重复喷施一次。喷施完成7 d 后取样研究ALA对羊草生长的影响，并且找出最佳的处理浓度；然后用这个处理浓度进一步研究其对植株营养积累、激素含量的影响及转录组分析。所有处理均3次重复。

1.2 生长与生理指标测定

株高:量取植株茎基部到顶叶尖端的距离；植物鲜重测定，去除羊草表面杂物然后用水冲洗干净，晾干后称重为鲜重。糖含量采用蒽酮比色法测定[26]；蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[27]；根系活力采用TTC(氯化三苯四氮唑)法测定[28]。植株硝酸还原酶(NR)采用离体法测定[29]；酸性磷酸酶(ACP)采用比色法测定[30]；苹果酸脱氢酶(MD)采用Sayre等[31]的方法测定。营养元素氮采用凯氏定氮法测定[32]；磷采用浓硫酸消煮，钼锑抗比色法测定[33]；钾采用浓硫酸消煮，原子吸收分光光度法测定[34]。脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米素(ZR)等植物内源激素含量采用固相抗体型酶联免疫吸附法 (ELISA) 进行测定[35]。

1.3 转录组分析

同时将羊草上部叶片采集后迅速置于-80 ℃液氮中速冻，贮藏备用。取混合样品提 RNA 进行转录组测序，具体方法是将实验材料置于液氮中研磨后，快速提取总 RNA，检测合格的样品用于后续试验。富集 mRNA，以其为模板，合成 cDNA，纯化后进行 PCR 扩增，得到最终的文库。用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量，检测合格后测序。利用RSEM软件对基因表达水平比对结果进行统计[36]，并对其进行 FPKM 转换后用于基因表达水平的分析和差异表达基因筛选[37]。基因差异表达的输入数据为基因表达水平分析中得到的 read count 数据。差异表达基因的筛选条件是先采用 TMM 对 read count 数据进行标准化处理，再用 DEGseq 进行差异分析，筛选阈值为 qvalue<0.005 且 |log2 Fold Change|>1。用 Gene Ontology 进行功能注释及分类，生物途径显著性富集分析[38]。测序分析委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司承担。

1.4 数据统计

采用Excel和SPSS软件进行数据统计分析。利用DPS 19.0软件进行单因素方差分析，以Duncan’s 新复极差法比较各处理间的差异性。

2 结果与分析

2.1 ALA对干旱胁迫下羊草植株生长的影响

由表1可以看出，经干旱胁迫(CK2)后的羊草幼苗株高、鲜重均显著降低，与CK1相比差异达显著水平，同时其根系活力也显著降低；但是植株的糖与蛋白质含量明显升高。经过不同浓度ALA处理后，这些指标与CK2相比都有一定的增加，有的与CK2相比达到差异显著水平。值得关注的是，当ALA浓度为50 mg·L-1(T50处理)时，各个指标都达到最大值，其株高、鲜重与根系活力指标甚至超过或与CK1相当，糖与蛋白质含量也达到最大值。T50处理与对照CK2相比较，其株高、鲜重与根系活力分别增加了40.6%，75.3%和65.2%。此外，与干旱胁迫CK2和对照CK1相比较，T50处理植株的糖含量分别增加了48.0%和95.4%；蛋白质含量分别增加了72.7%和200.1%。总之，适当浓度的ALA对在干旱胁迫下的羊草具有很好的缓解效应，增强了其幼苗的抗旱能力，可促进幼苗生长与物质积累，其中以施用ALA浓度为50 mg·L-1时的处理效果最佳。

2.2 ALA对干旱胁迫下羊草氮磷钾与营养代谢相关酶活性的影响

鉴于ALA浓度为50 mg·L-1(T50)时的处理对羊草抗旱的效果最好，本研究以此浓度处理又做了进一步的研究。由表2可以看出，在干旱下(CK2)羊草幼苗氮与磷含量降低，并且与CK1相比均达到差异显著水平；K含量略有下降。在经过ALA(T50)处理后，其氮、磷以及钾含量均有不同程度升高，特别是磷和钾含量不但显著高于CK2，而且还超过了CK1。与干旱胁迫CK2和对照CK1相比较，T50处理植株的P含量分别增加了37.1%和16.4%；K含量分别增加了21.4%和14.6%。分析比较与植株氮、磷、钾等营养代谢相关酶活性的变化，可以看出干旱胁迫下(CK2)羊草的硝酸还原酶和酸性磷酸酶活性均显著降低，而苹果酸脱氢酶活性则显著升高。经过ALA(T50)处理后，植株的硝酸还原酶和酸性磷酸酶活性有所提高，与CK2相比达到显著水平，但是没有恢复到CK1的水平。值得关注的是其苹果酸脱氢酶活性在ALA(T50)处理后显著降低。

表1 不同浓度ALA对干旱胁迫下羊草生长的影响Table 1 Effects of different concentration ALA on the growth of L. chinensis under drought stress

注：同列不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different letters mean significant different at 0.05 level. The same below.

表2 干旱胁迫下ALA对羊草N、P、K与营养代谢相关酶活性的影响Table 2 Effects of ALA on N，P，K and the enzyme activities of nutritional metabolism in L. chinensis under drought stress

2.3 ALA对干旱胁迫下羊草内源激素的影响

由表3可以看出，羊草的脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米素(ZR)等植物内源激素含量在干旱胁迫后(CK2)有很大的变化；其中ABA和IAA显著升高，GA3和ZR显著降低。经过ALA(T50)处理后，植株的内源激素含量进一步改变。如ABA含量降低了，但是仍然高于CK1；IAA、GA3及ZR则升高了。特别是IAA含量达到了最大值，分别比CK2和CK1增加了100.3%和158.5%。

表3 干旱胁迫下ALA对羊草内源激素含量的影响Table 3 Effects of ALA treatments on endogenous hormone in L. chinensis under drought stress (ng·g-1)

植物激素的相对比例对植株生长影响更大。由表4可以看出，干旱胁迫使羊草幼苗几类促进生长与细胞分裂的激素(IAA、GA3和ZR)和ABA的比值也发生了改变。经过干旱胁迫(CK2)，植株的IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均比正常水分处理(CK1)的比值有所下降，其总的(IAA+ZR+GA3)/ABA的值只有CK1的58%。当用ALA(T50)处理后，植株的IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均超过了CK2，其中IAA/ABA还超过了CK1。计算总的(IAA+ZR+GA3)/ABA的值，比CK2上升了148%，甚至与CK1相比也上升了44%。

表4 干旱胁迫下ALA对羊草内源激素比例的影响Table 4 Effects of ALA treatments on ratio of endogenous hormones in L. chinensis under drought stress

2.4 ALA对干旱胁迫下羊草生长差异表达相关基因分析

从转录组测序错误率可知，正常水分处理 (CK1) 的测序错误率在0.02%左右，干旱胁迫 (CK2) 测序错误率在0.02%左右，干旱胁迫+ALA(50 mg·L-1)处理 (T50) 的测序错误率在0.01%左右。CK1、CK2和T50分别得到测序数据为46818506，45746216，43609948，过滤后去除低质量的，得到过滤后用于组装的数据分别为45315832，44865196，42175670，过滤后质量不低于20的碱基的比例分别为97.30%、96.40%、97.64%，过滤后质量不低于30的碱基的比例分别为92.93%、91.13%、93.78%，GC比例(过滤后碱基G和C数占总碱基数的比例)分别为55.94%、55.73%、56.13%。这些数据表明测序所得的结果能用于后续的组装和转录组的分析(表5)。通过对转录组测序的比较分析，生长相关基因的查找过程使用了同源基因BLAST，发现以正常样品为对照(CK1)，在干旱胁迫下(CK2)共检测到1373个基因发生了显著差异表达，其中733个基因为显著下调表达；以CK2为对照，用ALA处理后(T50)共检测到1315个基因发生了显著差异表达，其中676个基因表达上调。

表5 测序产量及组装质量统计Table 5 Statistics of sequencing results and assembly quality

注：Q20，过滤后质量不低于20的碱基比例。Q30，过滤后质量不低于30的碱基比例。GC，过滤后碱基G和C数占总碱基数的比例。

Note: Q20，clean bases ratio that quality >20. Q30，clean bases ratio that quality >30. GC，clean bases ratio of G and C.

本研究对干旱胁迫 (CK2) 材料中下调表达的差异基因进行了GO富集分析。GO 注释由3个相对独立的部分组成，包括生物学过程、分子功能和细胞组分等，这3部分可以完整描述基因的所有生物学功能，有12条被注释到生物学过程中，23条被注释到分子功能中，14条被注释到细胞组分中。在对其中与生长密切相关的注释结果的分析表明(表6)：GO富集的条目中基因表达下调包括多个糖类代谢的条目，如碳水化合物代谢过程、葡萄糖解代谢过程、己糖代谢过程、单糖分解过程、碳水化合物分解过程。呼吸作用方面表达显著下调的有糖酵解中重要的磷酸甘油酸变位酶、磷酸己糖异构酶、磷酸甘油酸酯激酶、丙酮酸脱氢酶，还有呼吸作用电子传递链中的重要成分如NADH-辅酶Q氧化还原酶(复合体I)、F0F1-type ATP synthase(复合体Ⅴ)、辅酶Q-细胞色素C氧化还原酶(复合体Ⅲ)、铁氧还蛋白等。在血红素合成过程中起重要作用的四吡咯结合也被富集。此外，物质运输方面的蛋白跨膜运输活性、大分子物质运输活性都被显著富集。不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶omega-3 脂肪酸去饱和酶的基因表达也显著下调。这些基因的显著下调，严重影响羊草的正常生长发育、能量代谢与物质积累。

表6 羊草在干旱胁迫处理后生长相关下调差异基因的GO注释结果Table 6 GO annotation of the down-regulated genes related to growth in L. chinensis under drought stress

BP：生物学过程 Biological process；MF: 分子功能 Molecular function；CC: 细胞组分 Celelular component.下同 The same below.

对干旱胁迫下用ALA处理材料 (T50) 中上调表达的差异基因进行了GO富集分析。发现其中4条被注释到生物学过程中，13条被注释到分子功能中，1条被注释到细胞组分中。在对其中与生长密切相关的注释结果的分析表明(表7)：干旱胁迫下显著下降的一些代谢过程因喷施ALA显著上调。如糖酵解中重要的2,3-二磷酸变位酶，与细胞中各种膜成分密切相关的脂肪酸合成途径基因，电子传递的多个组分等。此外，氧化还原过程，四吡咯结合，单(双)加氧氧化还原酶活性，3-氧酰基-[酰基-运转蛋白]合成酶活性，ɑ-半乳糖苷酶活性，丝氨酸型肽链内切酶抑制剂活性等相关基因也显著上调。这些基因的显著上调，显然对羊草缓解逆境的伤害、恢复其正常生长发育、能量代谢与物质积累有很大帮助。

3 讨论

干旱胁迫是影响植物生长和代谢的主要逆境因素之一[39]。而植物对干旱胁迫的响应是通过分子、细胞和植物层面利用一系列生理生化反应来综合调控的[20]。通过采取不同的措施可以缓解或减轻干旱胁迫对植物的伤害，如用植物生长调节剂等处理[40]。韦品祥等[41]结果表明，在干旱胁迫下的金荞麦(Fagopyrumdibotrys)幼苗生长受到显著影响，但经不同浓度的ALA处理后各指标均得到一定程度的恢复。本研究表明(表1)，干旱胁迫使羊草的株高和鲜重等受到明显抑制，而适当浓度的ALA处理可恢复其生长，这与前述[5]研究外源ALA改善干旱胁迫下羊草幼苗的生长状况的结果一致。本研究还发现，在干旱胁迫下，植株的糖与蛋白质含量有所增加，印证了羊草对干旱有一定的适应能力；但采用不同浓度的ALA处理过后，羊草植株糖与蛋白质含量增加更为显著，表明ALA可以进一步提高植株抗旱性。根系活力是植物根系吸收、合成以及代谢能力的综合体现，它影响地上部的生长和营养状况，是一种较客观地反映根系生命活动的生理指标[42]。本研究表明，干旱胁迫下羊草幼苗植株根系活力下降，外施不同浓度的ALA使根系活力上升，其中ALA浓度为50 mg·L-1时根系活力达到最大值。综合分析其他指标，以ALA浓度为50 mg·L-1(T50)的处理又做了进一步的研究。

氮、磷和钾含量在植物代谢与营养中特别是干旱胁迫下的作用极其重要[43-44]。本研究表明(表2)，干旱胁迫导致羊草幼苗氮磷钾含量降低，而在经过ALA处理后，其氮磷钾含量均得以升高，特别是磷钾含量还超过了正常土壤含水量的处理，这是值得关注的现象。这些结果可能与在ALA处理后根系活力大大增强及生长代谢相关基因的上调有关。同时，与氮磷钾代谢相关的酶活性在干旱胁迫及ALA处理后，也发生了很大变化。已知硝酸还原酶活性与植株的氮代谢和生理功能密切相关[45]。酸性磷酸酶是一种诱导酶，其活性受磷的影响，是植物对缺磷胁迫的一种适应性反应[46]。苹果酸脱氢酶在植物体内广泛存在，有重要的生理作用，其活性与钾有密切关系[47-48]。本研究中干旱胁迫下羊草的硝酸还原酶和酸性磷酸酶活性均显著降低，苹果酸脱氢酶活性则显著升高；而在ALA处理后，植株的硝酸还原酶和酸性磷酸酶活性有所提高，但苹果酸脱氢酶活性则显著降低。氮磷钾含量在干旱胁迫与ALA处理之后的变化及其和几种酶活性变化的关系值得深入研究。

干旱胁迫条件下，植物体内激素的形成、比值及运输等发生了相应的变化，这些变化将直接影响植物生长与代谢[49]。本研究表明羊草的脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)及玉米素(ZR)等植物内源激素含量在干旱胁迫后均有改变，其中ABA和IAA显著升高，GA3和ZR显著降低(表3)。在逆境下植物体内的ABA、IAA、GA3和ZR等激素具有信号传导等作用，可关系到植物适应不良环境的能力，可直接影响植物对干旱胁迫的反应[50]。通常ABA干旱胁迫会升高，但本研究IAA在干旱下也升高，其中的原因值得研究。同时研究也发现，在干旱胁迫时经过ALA处理，植株的内源激素含量进一步改变。如ABA含量降低了，但是仍然高于正常的土壤水分含量处理；IAA、GA3及ZR则升高，特别是IAA含量还达到了最大值。植物激素对逆境下植物的调控方式较为复杂，植物对水分逆境较敏感，逆境下ABA的累积调控植物器官的衰老和脱落[51]；IAA在细胞乃至器官的伸长生长以及顶端优势方面都有显著影响[50]; GA3对茎的延长以及一些酶的合成方面有重要影响[52]; ZR对细胞分裂、膨大具有促进作用，同时也影响细胞衰老过程[53]。杨卫兵等[54]结果表明，水稻(Oryzasativa)通过外源调节剂处理后，可以明显改变植株内源激素ABA、GA3、IAA和CTK的含量，从而影响其生长与代谢，这与我们施用ALA后对羊草激素含量变化的规律相似。

不利环境可让植物体内的激素含量及活性发生改变，这些改变可影响植物的生理生化反应，激素间比值的变化在抗逆性中的作用更为重要。植物体内各激素间的相互影响可产生极其繁杂的调控系统，从而调节植物生长发育的众多代谢[55]。本研究表明，经干旱胁迫后，羊草幼苗几类促进生长与细胞分裂的激素(IAA、GA3和ZR)和ABA的比值也发生了改变，其中IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均比正常水分处理的比值有所下降(表4)。周芳等[56]关于干旱胁迫对苗期木薯(Manihotesculenta)内源激素含量影响研究有类似的变化趋势，IAA与ABA的比值会对植物的生长或衰老产生影响，二者具有拮抗作用；ZR/ABA与植物的顶端优势相关联；GA3/ABA可以影响植物的休眠作用。本研究还发现，当干旱时用ALA处理后，植株的IAA/ABA、ZR/ABA和GA3/ABA值均超过了仅用干旱处理；特别是总的(IAA+ZR+GA3)/ABA的值，不仅高于干旱胁迫，甚至还超过了正常的土壤水分含量处理。将这些内源激素的变化与前述的植株生长、物质积累、根系活力、氮磷钾含量及其相关酶活性的改变联系起来，推测ALA可能通过影响激素的含量与比例的信号转导方式调控羊草的生长代谢过程[57]，其中的机理需要进一步探讨。

转录组测序为研究植物抗性机理提供了方便，通过对转录组测序的比较分析，发现干旱胁迫与正常水分处理相比，有超过千个基因发生了显著差异表达，其中七百多个基因为显著下调表达。干旱胁迫处理后基因表达下调包括碳水化合物代谢过程、呼吸作用中重要的酶类以及电子传递链的成分、蛋白跨膜运输活性等(表6)。从整体来看羊草的代谢过程、催化活性、氧化还原等重要的途径在干旱胁迫时其基因表达受到了抑制，当然会对羊草的生长发育产生严重影响。特别是糖类物质的代谢尤其受影响，多个相关代谢过程基因表达显著下调。糖类化合物是一切生物体维持生命活动所需能量的主要来源，同时还具有特殊的生理活性。干旱造成的糖代谢基因表达的下调，严重影响到了羊草的相关生理代谢过程，也包括营养代谢过程。

外源ALA因可以缓解多种非生物胁迫对植物产生的不利作用，已经在较多作物中应用[11，58-59]。但是在各种逆境胁迫下，特别是干旱胁迫下ALA 对植物调控分子机理还没有研究清楚。本研究发现在干旱的同时用ALA处理后，与仅用干旱处理相比，也有超过千个基因发生了显著差异表达，其中600多个基因表达上调。特别是干旱胁迫下显著下降的一些代谢过程在喷施ALA后显著上调，如糖酵解中的酶、脂肪酸合成途径基因、电子传递的多个组分等；此外，氧化还原过程、氧化还原酶活性运转蛋白合成酶活性等相关基因也显著上调(表7)。这些基因表达显著上调保证了羊草植株产生ATP和还原力，维持相对正常的呼吸作用，满足植物体内各个生理过程对能量与物质代谢的需求。从总体上看羊草的代谢过程、氧化还原酶反应等这些在干旱胁迫下表达显著下调的代谢途径，在使用ALA处理以后表达都显著上调了，表明干旱胁迫下影响这些基因的正常表达，进而引起生理和生长的受害，而外源ALA的处理可以大大缓解干旱胁迫对这些生理过程的伤害。

转录组测序结果从基因水平证明了ALA调控羊草抗旱性提高的可能性，为进一步解析羊草应答干旱胁迫以及ALA提高羊草抗旱性的分子调控机制打下了基础。表6与表7的生长相关显著下(上)调基因有的也与营养代谢相关酶活性及激素代谢有一定联系，但其直接联系尚需进一步的证据。

4 结论

适当浓度的ALA可提高羊草株高、鲜重，增强根系活力，促进糖、蛋白、氮磷钾等物质积累，减轻干旱胁迫对羊草幼苗造成的伤害，这与ALA调控植株营养代谢相关酶活性、内源激素含量及其比值等生理效应密切相关，也与ALA在分子水平影响相关代谢的基因表达有直接联系。相关机理值得进一步研究。