木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl-K2HPO4双水相体系中相平衡数据的关联及分配模型的建立

朱新儒，余垒，张海德

（海南大学食品学院，海南海口570228）

传统的提取技术有盐析法、有机溶剂法、亲和层析法以及超滤法等[1]。然而这些技术存在诸如工艺过程繁琐、溶剂的组成成分有毒、提取率较低以及成本较高等局限性[2]。双水相（aqueous two-phase system，ATPS）萃取技术，亦称水溶液两相分配技术，是现阶段的一种分离新技术[3]。双水相体系的优点明显，如生物相容性高、操作时间短、设备简单、操作条件温和、易于连续化操作和工艺放大等[4]，因此被广泛运用。

近年来，国内外的学者们已经对双水相体系进行了全面的研究，包括新型双水相体系的开发、双水相体系中物理性质和热力学性质的测定，体系分配模型的建立、传质性能的研究、生物活性物质的分配行为、萃取工艺参数的优化、以及离子液体聚合物的回收[5-7]等，这些研究都已取得很大进展。国外关于双水相模型的研究较成熟些。Diamond等[8]提出了Diamond-Hsu模型，该模型在一定程度上对聚合物双水相体系的试验数据进行了很好的拟合。国内目前关于双水相模型的研究还不够完善，国内主要的模型是：渗维里模型、Flory-Huggins晶格模型、胞腔理论和局部组成模型。这4种理论相互独立，又互相影响，分别从渗透压、能量、分子间作用力及溶液组成几个方面进行了阐述[9]。此外，国内外的学者们对于双水相的研究现多集中在基于吡啶的离子液体上，因为相关研究已经表明，吡啶类物质的生物降解途径通常比其基于咪唑等的对应物更环保[10]。

现阶段，关于各类双水相体系相行为的研究层出不穷。Dragana P.C.de Barros等[11]在聚合物/聚合物ATPS中探讨具有不同性质的14种球状蛋白的分配行为。通过Colander方程，观察到所有系统中的蛋白分配系数之间的线性相关性。结果表明使用半经验模型，可以预测蛋白质的分配行为。Luisa A[12]对聚乙二醇/葡聚糖体系的分配系数与聚乙二醇的质量分数进行关联，结果表明对于双聚合物体系的分配系数的预测效果较好。

目前相关的研究报道酶在离子液体/盐双水相体系的分配系数K的大小主要是由盐析作用、表面电荷、疏水相互作用等因素共同决定的[13]，而对酶在氯代吡啶类离子液体双水相中分配行为的预测及模型建立的研究则较少。为探讨木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶类离子液体双水相体系中的分配规律，试验测定了[CnPy]Cl-K2HPO4双水相体系的双节线及液液相平衡数据并进行关联。进一步对木瓜蛋白酶在该体系中的蛋白浓度分配系数与上下相各成分浓度的相关度进行研究，以此建立木瓜蛋白酶在该类离子液体双水相体系中的分配模型，研究结果也可为木瓜蛋白酶在该体系中的工程放大设计计算提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

N-正乙基吡啶氯盐（EPyCl）、N-正丁基吡啶氯盐（BPyCl）、N-正己基吡啶氯盐（HPyCl）均为海南大学李运强理工实验大楼C513试验室合成的离子液体试剂（纯度＞90%）；木瓜蛋白酶（＞2 000 U/mg）：上海生工股份有限公司；K2HPO4（AR）、氢氧化钠（AR）、盐酸（AR）：阿拉丁化学试剂公司；其他所有试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

FA2104分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PHS-2F PH计：上海雷磁仪器厂；2WAJ阿贝折射仪：上海光学仪器一厂；TU1810紫外可见分光光度计：北京普析通用有限责任公司；DK-98-1恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；DF-2A集热式磁力搅拌器：常州华奥仪器制造有限公司；WH-866旋涡混合器：太仓市华利达试验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 相图的测定

参照高向阳等[14]方法，测定相图：在25℃的体系环境下，采用清-浊点辅助相图制作法测定氯代吡啶类离子液体双水相体系的双节线。进一步选取适当的点配制相应浓度的溶液体系，绘制三角相图。分别量取质量分数为 50%的 [C2Py]Cl、[C4Py]Cl、[C6Py]Cl溶液放在10.0 mL小试管中，用移液枪逐滴向小试管中滴加质量分数为35%的K2HPO4溶液，用旋涡混合器振荡，观察到体系出现浑浊点为止。在分析天平上称量后计算出氯代吡啶类离子液体溶液和K2HPO4溶液在浑浊点时对应的质量分数。随后向已浑浊的双水相体系中逐滴加入超纯水，观察到体系又变澄清为止，即出现清点。准确称量后，再向试管中滴加质量分数为35%的K2HPO4溶液，至体系再次变浑浊为止。依次交替加入超纯水和K2HPO4溶液，计算每一个清点、浊点对应的质量分数。

1.3.2 双水相相平衡的测定

参照卢艳敏等[15]方法，根据三角相图选取适当质量分数的点配制双水相体系。在25℃的恒温环境下，分别量取不同质量的氯代吡啶类离子液体溶液和K2HPO4溶液加到10.0 mL离心管中，随后补加超纯水，在旋涡混合器中振荡30 min，在该环境温度下放置2.0 h，待溶液上下相分相清晰，确保体系达到完全平衡。按照参考文献[16]中所述，用折射率来确定双水相体系上下相的氯代吡啶类离子液体的质量分数，通过酸碱中和滴定法[17]来确定两相中K2HPO4的质量分数。

折射率n、氯代吡啶类离子液体的质量分数wil、K2HPO4的质量分数ws，三者关系式如下：

式中：a0、a1、a2为方程参数，见表1。

表1 [CnPy]Cl-K2HPO4双水相方程式（1）参数Table 1 Parameters of equation（1）for[CnPy]Cl-K2HPO4 aqueous two-phase system

1.3.3 氯代吡啶类离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶及蛋白浓度的测定

参照邵琳琳等[18]方法，根据三角相图选取适当质量分数的点配制双水相体系。向10.0 mL离心管中加入氯代吡啶类离子液体溶液和K2HPO4溶液，使双水相体系的总体积为1.0 mL。再加入质量浓度为2.0 mg/mL（木瓜蛋白酶的质量/双水相体系总体积）酶溶液，调节体系pH值为7.0，旋涡混合器中振荡30 min，在25℃温度下放置2.0 h，使溶液上下相完全分相。将上、下相液分离并准确读取体积。用超纯水将上、下相液均稀释10倍，备用。吸取1.0 mL的待测溶液转移到10.0 mL试管中，再向试管中加入5.0 mL考马斯亮蓝（G-250）染色液，充分振荡使之混匀。设置空白对照组，不加酶溶液，在595 nm波长处比色，读取吸光值A，计算木瓜蛋白酶的蛋白含量[19]。由于实际操作过程中仅添加了较少量的木瓜蛋白酶，对折射率的测定影响较小，相对误差小于0.2%，所以使用该方法测定组分含量的结果准确。

以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白，测定其溶液在不同浓度下的吸光度值，绘制BSA-Abs标准曲线。曲线公式为：y=0.013 6+0.004 5x，R2=0.998 1，符合质量分析标准，结果见图1。

图1 BSA-Abs标准曲线Fig.1 BSA-Abs standard curve

1.3.4 数据处理及分析

采用Origin8.5处理试验数据，每组处理均做3次重复。

2 结果与分析

2.1 体系双节线数据的关联及三角相图的绘制

试验中运用Merchuk方程关联体系的双节线数据，并绘制体系的三角相图，Merchuk方程形式如下：

式中：a、b、c为方程拟合参数，利用浊点数据的最小二乘回归算出；wil和ws分别代表[CnPy]Cl和K2HPO4的质量分数。Merchuk方程的形式简单，较好地运用于离子液体/盐双水相体系的双节线数据的关联，且关联效果较好[20]。分别以氯代吡啶类离子液体、K2HPO4、水为3个顶点，制作三角相图，见图2。

图2 25℃温度下[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4双水相体系三角相图Fig.2 Triangular phase diagram for[CnPy]Cl（n=2，4，6）-K2HPO4 system at 25℃

由图2（a）、2（b）、2（c）可得，双节线是单相区与双相区的临界线，表示双水相达到平衡，双节线左侧是单相区，此时溶液是均一的相，无分层现象；右侧是双相区，它是无限多个不同浓度组成的两相系统，上相是氯代吡啶离子液体富集相，下相是K2HPO4富集相。25℃时[CnPy]Cl-K2HPO4体系双节点关联结果见表2。

表2 25℃时[CnPy]Cl-K2HPO4体系双节点关联结果Table 2 Binodal correlation results of[CnPy]Cl-K2HPO4system at 25℃

由表2可知，试验所得的双节线数据能很好地满足Merchuk方程，可为此体系双水相相图的绘制提供参考，且可根据相图，选择双水相体系成相剂的浓度。

2.2 运用Othmer-Tobias方程和Bancroft方程拟合体系的液液相平衡关系

Othmer-Tobias方程和Bancroft方程近年来已经成功应用于拟合离子液体/无机盐双水相体系的液液相平衡关系，Othmer-Tobias方程和Bancroft方程的表达式分别如下[21]

式中：K、n、K'、n'为方程的参数，见表3；wilt代表上相离子液体的质量分数，wsb代表下相K2HPO4的质量分数；wwt、wsb分别代表上、下相水的质量分数。对方程两边取对数，在Othmer-Tobias方程中，以lg[（1-wwb）/wwb]为横坐标，以lg[（1-wilt）/wilt]为纵坐标，进行拟合并绘制图3。在Bancroft方程中，以lg[wwt/wilt]为横坐标，以lg[wwb/wsb]为纵坐标，进行拟合并绘制图4。式中，n、n'为斜率，lgK、lgK'为截距。

表3 [CnPy]Cl-K2HPO4双水相方程式（3）和（4）中的参数Table 3 Parameters of Equation.（3）and（4）for[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

图3 Othmer-Tobias方程的线性相关性Fig.3 Linear dependency of Othmer-Tobias equation

从表3中的 R2值（＞0.995）可看出，Othmer-Tobias方程和Bancroft方程很好地拟合了试验中的双水相体系的液液相平衡数据。

由图3、图4可得，lg[（1-wwb）/wwb]与lg[（1-wilt）/wilt]，lg[wwt/wilt]与 lg[wwb/wsb]分别呈线性关系，表明相关性很好。

由相关参数和体系下相中各组分的质量分数可以计算出体系上相中各组分的质量分数。体系的液液相平衡数据见表4。

由表4可得，[C2Py]Cl、[C4Py]Cl和 [C6Py]Cl的平均相对误差分别为：0.72×10-3%、-3.95×10-3%、0.75×10-3%；K2HPO4的平均相对误差分别为：-0.65×10-3%、-2.20×10-3%、-1.13×10-3%。由此可得方程拟合结果较满意。

图4 Bancroft方程的线性相关性Fig.4 Linear dependency of Bancroft equation

2.3 分配模型的建立

离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶，酶的蛋白浓度分配系数K定义为：双水相体系分相后，上、下相中各自的木瓜蛋白酶蛋白浓度的比值，公式如下

式中：Ct、Cb分别为上、下相中的木瓜蛋白酶蛋白浓度，mg/mL。

表4 25℃时[CnPy]Cl-K2HPO4双水相体系的液液相平衡拟合结果Table 4 The result of liquid-liquid equilibrium for[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system at 25℃

测定该体系上下相中木瓜蛋白酶浓度及各组分的含量，对上下相各组分含量和分配系数K之间的相关性进行分析，相关性越接近于1，说明相关性越好[22]，数据则可用于模型的建立；反之，相关性差不可用。选择相关性接近1的一组或几组数据，进行模型的建立。

变量x和y之间的相关性定义为：

木瓜蛋白酶的分配系数与参数的相关性见表5。

由表5可得，上下相离子液体浓度差、上下相盐浓度差与lnK的相关性较高，均在0.75以上。

将上下相中氯代吡啶类离子液体的浓度差、上下相中K2HPO4的浓度差与该双水相体系的lnK值进行关联，得出如下公式：

式中：A、B、C为方程参数，L=（wil2+ws2）1/2（wil：上、下相中氯代吡啶类离子液体的浓度差；ws：上、下相K2HPO4的浓度差）。分别以[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4双水相体系中的L值为横坐标，以lnK值为纵坐标，利用K与L（系线的长度）[23]之间的相关性建立了模型。

模型的参数、分配系数的预测值与试验值的相对偏差见下表6。

表5 分配系数与[CnPy]Cl-K2HPO4双水相体系组分浓度的相关性Table 5 Correlation between partition coefficient and the components concentration of[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

表6 模型的参数和分配系数预测值与试验值的相对偏差Table 6 Parameters for models and relative deviations between predicted and experimental partition coefficient

由表6可得，与其他离子液体双水相体系，如曹玲[24]研究的[Emim][（CF3SO2）2N]体系的分配模型（相对偏差为8.36%）相比，试验建立的模型有更小的平均相对偏差。试验值与计算值之间一致性良好，表明该模型预测能力很好。

木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶类离子液体双水相体系中的蛋白浓度分配系数和上下相组分浓度差的关联结果见图5、图6和图7。

图5 [C2Py]Cl-K2HPO4双水相体系中木瓜蛋白酶的分配系数的实验值与模型预测值Fig.5 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C2Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

图6 [C4Py]Cl-K2HPO4双水相体系中木瓜蛋白酶的分配系数的实验值与模型预测值Fig.6 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C4Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

图7 [C6Py]Cl-K2HPO4双水相体系中木瓜蛋白酶的分配系数的实验值与模型预测值Fig.7 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C6Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

由图5～图7可知，相关系数R2分别为0.985、0.993、0.981，结果较满意。该模型的相对偏差均小于4%，并且与蔡涛[25]研究的[Cnmim]BF4-NaH2PO4咪唑类离子液体/盐双水相体系的分配模型（相对偏差5%）相比较小，表明本试验建立的模型精确度得到进一步提高，并且能够实现对木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶类离子液体/盐双水相系统中分配系数K的准确预测。

3 结论

试验在25℃条件下，利用清-浊点辅助法测定了[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶类离子液体/盐双水相体系的双节线数据及液液相平衡数据，并绘制该体系的三角相图。用Merchuk方程、Othmer-Tobias和Bancroft方程拟合数据，相关系数R2均达到0.995以上，平均相对误差均低于0.1%，结果表明试验数据的拟合效果很成功。进一步用 [CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4双水相体系探讨不同碳链长度的氯代吡啶类离子液体对木瓜蛋白酶的分配系数的影响规律，建立的模型可较好地预测不同碳链长度的氯代吡啶类离子液体对木瓜蛋白酶的萃取能力，补充了酶在双水相系统的分配模型数据库。