IL-1β促进naïve T细胞向Th22细胞分化及在非小细胞肺癌中表达的相关性研究

杨 毅， 官俏兵， 郭 丽， 韩晨阳

(嘉兴市第二医院， 浙江 嘉兴 314001)

Th22细胞亚群是近年来新发现的一类CD4+T细胞亚群，Th22细胞在炎症反应、自身免疫性疾病和肿瘤转移中都发挥着重要的作用[1]，有研究表明Th22细胞分泌的白细胞介素22(interleukin-22, IL-22)在多数肿瘤组织中存在高表达，而IL-22在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的高表达是通过STAT3信号介导的[2]。IL-1β作为一种炎症因子，目前研究主要集中在NLRP3小体的活化，也有文献报道IL-1β可以促进非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移，其作用与免疫抑制有关[3]。虽然IL-22和IL-1β在肿瘤组织中都存在高表达，但是鲜有二者关系的报道，而且Th22细胞分化激活的作用机制尚不明确。本文主要研究IL-1β诱导naïve T细胞向Th22细胞分化的机制，并探讨其在非小细胞肺癌患者外周血中表达的临床意义。

材 料 和 方 法

1 病例与材料

1.1病例的选择 选择2016年1月～2017年7月我院收治的非小细胞肺癌患者60人和健康志愿者25人。非小细胞肺癌患者中I期18人，II期20人，III期13人，IV期9人，男性38人，女性22人，年龄55～78岁，平均(64.2±5.4)岁；健康志愿者中男性16人，女性9人，年龄52～73岁，平均(62.2±3.8)岁。本研究符合伦理规范，试验对象均知情同意。

1.2实验材料 FITC标记的抗人CD4、PE标记的抗人IL-22、PE标记的抗人CD3、PerCP标记的抗人CD44和APC标记的抗人CD62L抗体(eBioscience)；IL-22的ELISA试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司); 重组人IL-1β和重组人IL-2(武汉艾美捷科技有限公司);TGF-β(R&D);培养基(武汉普诺赛生物技术有限公司)。

2 方法

2.1标本的采集 所有受试者在禁食12 h后于次日清晨空腹采血于肝素抗凝管，将全血分为2份，其中1份用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，另一份血样离心后将血清分离，用于进行ELISA实验。健康志愿者全血分离血清后，取血细胞进行naïve T细胞的提取。

2.2流式细胞术检测Th22细胞 24孔板中每孔加入PBMC 2×106个左右，每孔加入RPMI-1640培养基1 mL后培养5 h。收集细胞于EP管，离心后用PBS洗2次，加入PBS 100 μL重悬后，加入FITC标记的抗人CD4抗体，避光孵育30 min，离心后去掉上清， PBS洗2次，加入PE标记的抗人IL-22抗体，避光30 min后，PBS洗2次，250 μL PBS重悬后检测，标本均做同型对照，结果以CD4+IL-22+T细胞在CD4+T细胞中所占比例进行统计。

2.3ELISA法检测血清IL-22和IL-1β的含量 按照ELISA试剂盒操作。

2.4Naïve T细胞的分选和鉴定 健康人的全血细胞分离得到PBMC后，采用人CD4+naïve T细胞磁珠分选试剂盒进行PBMC中CD4+naïve T细胞的分选。分离得到的naïve T细胞加入PE标记的抗人CD3、FITC标记的抗人CD4、PerCP标记的抗人CD44和APC标记的抗人CD62L抗体，利用流式细胞术鉴定CD3+CD4+CD44-CD62L+细胞(即CD4+naïve T细胞)的比例。

2.5IL-1β诱导Naïve T细胞的分化 将分离得到的naïve T细胞分为3组，分别为对照组(TGF-β+IL-2)、实验组(TGF-β+IL-2+IL-1β)和阴性对照组(抗人IL-1β抗体+TGF-β+IL-2+IL-1β)，每组设置3个复孔，细胞数为2×105，其中IL-1β的终浓度为100 μg/L，抗人IL-1β抗体的浓度为100 μg/L，诱导24 h后流式细胞术检测CD4+IL-22+T细胞在CD4+T细胞中的比例。

2.6培养基中IL-22的测定 收集上述培养后的培养基按照ELISA试剂盒操作测定培养基中IL-22的水平。

3 统计学处理

利用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料均以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Naïve T细胞分选结果

通过磁珠分选后，采用流式细胞术检测，结果显示分离得到的CD3+CD4+CD44-CD62L+T细胞的比例为93.8%，纯度较高，可以用于诱导分化实验，见图1。

2 IL-1β诱导naïve T细胞的分化

经过24 h的诱导后，对照组细胞中CD4+IL-22+T细胞的比例为(0.32±0.05)%，而实验组中CD4+IL-22+T细胞的比例为(35.32±4.21)%，阴性对照组中CD4+IL-22+T细胞的比例为(19.53±5.14)%，结果表明IL-1β可以诱导naïve T细胞向Th22分化，且实验组与对照组及阴性对照组间的差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

3 IL-1β诱导naïve T细胞的分化后培养基中IL-22的含量变化

Figure 1. The proportion of naïve T cells after separation from magnetic beads.

图1磁珠分选后naïveT细胞的比例

Figure 2. The proportion of Th22 cells after IL-1β induction. A: control group; B: experimental group; C: negative control group.

图2IL-1β诱导分化后Th22细胞的比例

对照组培养基中IL-22的含量为(832.25±212.30) ng/L，实验组中IL-22的含量为(3 685.32±189.62) ng/L，阴性对照组中IL-22的含量为(1 657.35±234.30) ng/L,实验组中IL-22的含量明显高于对照组和阴性对照组(P<0.05)，说明IL-1β诱导Th细胞分化的同时还可以促进IL-22的分泌。

4 非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞比例的变化

通过流式细胞术检测发现，非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞的比例显著高于对照组(P<0.05)，见图3。

5 非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞的比例与临床分期的关系

通过统计，I期患者Th22细胞的比例为(0.92±0.15)%，II期为(1.35±0.54)%，III期为(1.74±0.85)%，IV期为(1.98±0.68)%，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，各组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)，见图4。

6 外周血中IL-1β表达与Th22细胞比例的相关性

将外周血中Th22细胞所占比例和IL-1β含量进行相关性分析，结果显示IL-1β含量和Th22细胞比例密切相关(r=0.843，P<0.05)，见图5。

Figure 3. The proportion of Th22 cells in peripheral blood of the patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).

图3非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞的比例

7 外周血中IL-22表达与临床分期的关系

I期患者外周血IL-22的含量为(11.57±1.58) ng/L，II期为(13.42±0.98) ng/L，III期为(15.35±1.19) ng/L，IV期为(20.23±0.90) ng/L，较对照组明显升高(P<0.05)，组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)，见图6。

Figure 4. The relationship between the proportion of Th22 cells in the peripheral blood and the the clinical stage of the non-small cell lung cancer patients.

图4外周血中Th22细胞比例与临床分期的关系

Figure 5. The correlation between the expression of IL-1β and the proportion of Th22 cells in peripheral blood.

图5外周血中IL-1β表达与Th22细胞比例的相关性

Figure 6. The relationship between the expression of IL-22 and the clinical stage. Mean±SD.

图6IL-22表达与临床分期的关系

讨 论

辅助性T淋巴细胞是免疫系统中重要的免疫调节性细胞，根据产生的细胞因子不同可以分为Th1、Th2、Th9、Th7和Th22等亚群。Th22细胞是新发现的一类辅助性T细胞，目前认为其参与了机体的慢性炎症反应、自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展等。Th22细胞是CD4+T淋巴细胞的亚群，能高水平表达IL-22和干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)。在浆细胞样免疫细胞的刺激下，TNF-α和IL-6等可以促进CD4+T细胞向Th22细胞分化，而CCR6等趋化因子也可以反馈促进Th22细胞的分化[4-6]。在肿瘤的研究中发现，CD4+细胞受到肿瘤微环境的控制，可以在微环境中实现分化，IL-22是Th22细胞的最关键的细胞因子，与Th22细胞组成共同效应的整体，Wang等[7]的研究发现IL-22可以促进肝脏肿瘤和肝癌的易感性；Jiang等[8]和Zhuang等[9]发现IL-22在人类原发性肝癌浸润组织中浸润的淋巴细胞中存在高表达，且与分期有关；Park等[10]发现，IL-22转基因小鼠肝脏IL-22上调可以促进肝炎向肝癌转化；Ye等[11]发现Th22细胞在恶性胸腔积液中的比例显著高于外周血，其作用可能与CCR6有关；Zhang等[12]发现，非小细胞肺癌患者中，肿瘤组织及胸腔积液可以检测出高水平的IL-22，肿瘤通过自分泌方式分泌IL-22提高了肿瘤细胞抗凋亡的作用。IL-1β的主要功能是促进内源性的致热源参与炎症反应，几乎有核的细胞都可以表达IL-1β。IL-1β可以介导炎症反应，活化趋化因子、环氧化酶等炎症因子的表达，参与肿瘤恶液质的产生等。现有研究表明，在肿瘤组织中存在较高水平的IL-1β与多种辅助性T细胞，IL-1β可以促进Th9细胞的增殖并参与肿瘤组织的免疫抑制[13]。

本研究发现在非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞及其细胞因子IL-22和IL-1β的水平较高，且IL-1β与Th22细胞比例存在高度的相关性，所以我们分离人外周血中naïve T细胞，进行体外IL-1β刺激，结果显示体外IL-1β可以促进naïve T细胞向Th22细胞分化，而非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞比例和IL-22表达相比正常人增高，且Th22细胞比例和IL-22表达与临床分期相关。体内外实验存在一致性，表明Th22细胞的分化和激活与IL-1β有关，推测二者共同作用调控炎症反应和免疫抑制，从而促进肿瘤的发生发展。

综上所述，本研究发现IL-1β可以促进naïve T细胞向Th22细胞转化且促进关键细胞因子IL-22的表达，在非小细胞肺癌患者外周血中Th22细胞比例和IL-1β水平存在高度相关性，Th22细胞比例和IL-22水平与临床分期相关，三者可以作为非小细胞肺癌进展及预后的参考指标，但是Th22细胞对于非小细胞肺癌的作用还有待进一步研究。