X线电离辐射诱导人鼻咽癌CNE-2细胞发生上皮-间充质转化及其潜在机制*

余 丹， 刘 霞， 范婉琳， 安 祥， 李 兵

(重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科， 重庆 400016)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种起源于鼻咽部黏膜上皮的恶性肿瘤，多为低分化鳞癌，其发病率和死亡率均居头颈部恶性肿瘤之首[1]。放疗作为一种运用电离辐射(ionizing radiation，IR) 达到治疗目的的医学方法，是鼻咽癌的首选治疗手段[2]。近年来，局部复发和远处转移是鼻咽癌放疗失败的主要原因，而关于放疗后鼻咽癌局部复发和远处转移的机制尚不清楚。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是指在特定的生理和病理情况下，具有极性的上皮细胞向具有移行能力的间充质细胞发生转化的过程[3]。有研究报道EMT与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[4]，但IR是否能诱导鼻咽癌细胞发生EMT，促进其侵袭和转移能力，目前尚不清楚。因此，本研究通过采用不同剂量的X线照射鼻咽癌CNE-2细胞，观察细胞形态的改变，检测细胞侵袭和转移能力及EMT相关蛋白的表达，旨在探讨电离辐射对鼻咽癌细胞上皮间质转化的影响及其可能参与的信号通路。

材 料 和 方 法

1 材料和主要试剂

人鼻咽癌细胞株CNE-2由本实验室保存；RPMI-1640培养液和胎牛血清购自Gibco；总RNA提取试剂盒(HiPure Total RNA Mini Kit)购自广州美基生物科技有限公司；PCR引物合成、反转录试剂盒(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)及实时荧光定量PCR检测试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)购自TaKaRa；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、蛋白酶抑制剂、鼠抗人单克隆抗体GAPDH和HRP标记的山羊抗小鼠IgG均购自上海碧云天生物技术研究所; HRP标记的山羊抗兔IgG购自Abcam；鼠抗人单克隆抗体N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)购自Santa Cruz；鼠抗人单克隆抗体E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Akt和兔抗人单克隆抗体 p-Akt购自Cell Signaling Technology; Transwell小室(24 孔，孔径8.0 μm)购自Corning; Matrigel购自BD。

2 主要方法

2.1细胞培养和照射条件 人鼻咽癌CNE-2细胞株常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养混合液中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，定期观察细胞生长情况，待细胞融合至80%左右时，弃培养液，PBS洗2次，用0.25%的胰酶消化细胞，进行传代培养。本实验的电离辐射为直线加速器的X射线，由重庆医科大学附属第一医院肿瘤科放射治疗室提供仪器平台及技术支持。剂量率采用2 Gy/min，累积剂量分别为0 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy，源皮距(source-skin distance，SSD)为100 cm，照射野为25 cm×25 cm。

2.2显微镜观察细胞形态学 取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞株均匀接种在细胞培养皿中，经不同强度(0 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy)的电离辐射处理24 h后，置于全自动倒置显微镜上，观察未照射与照射后细胞形态的变化情况。

2.3细胞划痕实验 用标记笔在60 mm细胞培养皿背面等距画5条横线，取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞种入培养皿中，待细胞贴壁生长至融合时，用10 μL的吸头于细胞层上垂直底面横线取垂线，PBS 洗3遍，换无血清细胞培养液后电离辐射处理(0 Gy和4 Gy)，倒置显微镜下观察并捕捉不同时间段(0 h、24 h和48 h)的划痕图片。

2.4Transwell实验

2.4.1迁移实验 往24 孔板加入500 μL 含10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养混合液，然后将 Transwell 小室置于24孔板中。 取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞用无血清细胞培养液制成细胞悬液(含5 000 个细胞)加入Transwell小室上层，经电离辐射(0 Gy和4 Gy) 处理24 h 后，取出小室，弃培养液，PBS 洗涤3次后，经甲醇固定 10 min、0.1% 结晶紫染色20 min、PBS洗涤3次，用棉签擦去小室上层未迁移细胞，自然晾干后于光学显微镜下随机选取5个独立视野(×100)，对迁移到小室下层的细胞进行计数。

2.4.2侵袭实验 实验前预冷的Matrigel胶用不含血清的 RPMI-1640 培养液以1∶3稀释，然后取100 μL稀释胶均匀铺到 Transwell 小室上层，放入CO2培养箱过夜。随后，取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞用无血清细胞培养液制成细胞悬液(含1×104细胞)加入 Transwell 小室上层，经电离辐射(0 Gy和4 Gy)处理 24 h。后续实验操作同迁移实验。

2.5Real-time PCR 根据总RNA提取试剂盒说明书分别提取经不同强度(0 Gy、2 Gy、4 Gy和8 Gy)的电离辐射处理24 h后细胞的总RNA，紫外分光光度计定量并计算A260/A280比值。反转录采用TaKaRa 公司的逆转录试剂盒Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 进行反转录:先去除基因组DNA，取 1 μg总RNA，依次加入2 μL 5 × gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser，加入 RNase Free dH2O 至总体积为 10 μL，室温放置5 min；接着反转录，配制Master Mix:1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix, 4 μL 5 × Prime Script Buffer 2, 4 μL RNase-free dH2O, 与去除基因组DNA反应液混合，总体积为 20 μL，于 PCR 仪上采用 37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的条件进行反应。采用荧光试剂 SYBR Premix Ex TaqTM进行定量 PCR 检测，反转录的 cDNA 产物稀释20倍后作为 PCR 的模板。反应体系为 10 μL。反应程序如下:95 ℃预变性 30 s; 95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，总共40个循环; 72°C至 95 ℃熔解曲线分析5 s。采用2-ΔΔCt法分析定量PCR的结果。实验重复3次。相关基因的引物序列见表 1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

2.6Western blot实验 提取各组细胞总蛋白，预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液充分裂解细胞，4°C、12 000×g离心15 min，取上清液，BCA 蛋白定量检测试剂盒进行蛋白定量。每组各取蛋白 40 μg 行 8% SDS-PAGE，将分离后的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，用含 5% 脱脂奶粉的TBST封闭2 h; 加入Ⅰ抗(GAPDH稀释度为1 ∶2 000; E-cadherin稀释度为1∶500; N-cadherin稀释度为1∶1 000; vi-mentin稀释度为1∶1 000; Akt稀释度为1∶1 000; p-Akt稀释度为1∶1 000) 4 ℃孵育过夜; 用TBST洗涤后，再加入HRP标记的IgG (1∶5 000 稀释)，于室温下反应1 h; TBST洗膜，滴加ECL显色液，化学发光成像系统采集结果，用ImageLab 3.0软件分析条带。实验重复3次。

3 统计学处理

用SPSS 21.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 电离辐射对鼻咽癌CNE-2细胞形态的影响

实验结果表明，未照射(0 Gy)组细胞呈椭圆多边形，且边缘整齐，细胞连接紧密；而照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)组细胞呈细长梭形或纺锤形，且伸出伪足，细胞间隙增大，与EMT典型的细胞形态改变类似，见图1。

Figure 1. Ionizing radiation induced morphological changes consistent with EMT in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells.

图1IR诱导鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT相关形态学改变

2 电离辐射对鼻咽癌CNE-2细胞侵袭和迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与未照射(0 Gy)组细胞比较，照射(4 Gy)组细胞24 h和48 h细胞迁移距离均增加(P<0.01)，见图2。Transwell实验结果和划痕实验结果一致，与未照射(0 Gy)组细胞比较，照射(4 Gy)组细胞24 h穿膜细胞数显著增加(P<0.01)，见图3。

3 电离辐射对鼻咽癌CNE-2细胞EMT表面标志蛋白表达的影响

Real-time PCR结果显示，与未照射(0 Gy)组细胞比较，照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)组细胞E-cadherin mRNA 的表达显著降低(P<0.01)，N-cadherin和vimentin mRNA 的表达显著升高(P<0.01)，见图4。Western blot结果显示，与未照射(0 Gy)组细胞比较，照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)组细胞 E-cadherin 的表达显著降低(P<0.01)，N-cadherin和vimentin的表达显著升高(P<0.05)，见图5。

4 电离辐射对PI3K/Akt信号通路的影响

Western blot实验结果显示，与未照射(0 Gy)组细胞比较，照射(2 Gy、4 Gy和8 Gy)组细胞p-Akt的水平显著升高(P<0.01)，而Akt的表达无明显变化，见图6。

Figure 2. Effects of ionizing radiation on migration of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

图2IR对鼻咽癌CNE-2细胞迁移能力的影响

Figure 3. Effects of ionizing radiation on migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

图3IR对鼻咽癌CNE-2细胞侵袭能力的影响

讨 论

虽然放疗在鼻咽癌治疗中广泛应用，但已有研究报道，电离辐射在杀伤肿瘤细胞的同时，还能促进多种组织来源肿瘤细胞的侵袭。Wildbode等[5]给予亚致死剂量的电离辐射增加胶质瘤细胞侵袭转移能力；Kaliski等[6]给予黑色素瘤细胞不同剂量的X线照射后，细胞侵袭能力增强，且侵袭能力跟放射剂量呈正比。陆续的研究表明，放疗后结肠癌细胞[7]、乳腺癌细胞[8]和肺癌细胞[9]体外侵袭和迁移能力均有不同程度地增加，而EMT与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[4]。

Figure 4. Effects of ionizing radiation on the mRNA expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

图4IR对鼻咽癌CNE-2细胞E-cadherin、N-cadherin和vimentinmRNA表达的影响

EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的分子基础，主要特征包括细胞形态从上皮型转化为间充质型、上皮细胞标志物E-cadherin表达降低及间充质标志物N-cadherin和vimentin表达升高[10]。近些年来研究发现，EMT在电离辐射增加肿瘤细胞转移潜能中发挥着重要作用。低剂量的电离辐射能诱导乳腺癌细胞发生EMT，增加乳腺癌细胞侵袭能力[11]；体内外实验均证实X射线可提高肝癌细胞的侵袭和转移潜能，促进细胞发生EMT改变[12]。同时，本课题组前期研究成果表明，经不同剂量的X线照射后食管癌细胞发生EMT并增加转移潜能，与IL-6/STAT3/TWIST信号通路的激活有关[13]。因此推测，X线电离辐射可能诱导人鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT，从而促进其侵袭和转移能力。

Figure 5. Effects of ionizing radiation on the protein expression of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 Gy group.

图5IR对鼻咽癌CNE-2细胞E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白表达的影响

Figure 6. Effects of ionizing radiation on the protein levels of Akt and p-Akt in nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 Gy group.

图6IR对鼻咽癌CNE-2细胞Akt和p-Akt蛋白水平的影响

本研究采用不同剂量的X线照射人鼻咽癌CNE-2细胞，倒置显微镜观察照射后细胞形态由椭圆多边形向细长梭形转化，细胞间紧密结合逐渐变得松散，呈典型的EMT样改变，且随着X线照射剂量的增加，细胞形态向间充质型转化更明显。由此猜想，IR可能诱导CNE-2细胞发生EMT。侵袭和迁移能力增加是肿瘤细胞发生EMT最显著的功能改变，为探讨IR诱导鼻咽癌细胞发生EMT是否伴随着EMT相关功能的改变，我们对人鼻咽癌CNE-2细胞给予4 Gy X射线照射，划痕实验结果显示照射后的CNE-2细胞迁移能力明显比未照射时增强；同时，Transwell迁移和侵袭实验证实与未照射组相比，照射后的CNE-2细胞迁移和侵袭能力显著增强。这提示IR可能通过诱导鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT从而增加体外迁移和侵袭能力。为进一步从分子层面探讨IR是否可诱导鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT，我们采用real-time PCR和Western blot分别检测EMT相关蛋白的表达情况，结果显示，各照射组细胞E-cadherin表达明显降低，而N-cadherin和vimentin表达均显著升高，这提示IR可诱导鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT。以上结果与其他学者研究结论相似。Chen等[14]为研究Akt分子与鼻咽癌放射抗性的关系，采用5 Gy剂量的X线照射鼻咽癌细胞，结果表明鼻咽癌细胞发生EMT且迁移侵袭能力增加；Su等[15]为观察放疗后残余鼻咽癌细胞的恶性行为，采用梯度递增的辐照模式照射鼻咽癌细胞株CNE-2和6-10B后成功构建IR抵抗株，在辐射剂量累积的过程中检测出鼻咽癌细胞发生EMT。由此可见，本研究从形态及分子层面揭示X线电离辐射可诱导鼻咽癌CNE-2细胞上皮间质转化，但具体机制仍未明确。

为进一步探索IR诱导鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT的分子机制，我们采用Western blot检测Akt和p-Akt蛋白水平的变化，结果显示，PI3K/Akt信号通路中p-Akt的水平显著升高，而Akt的表达无明显变化。有研究表明，磷酸化的Akt可通过直接上调转录因子表达或间接促进金属蛋白酶表达等多种途径降低E-cadherin 表达，引起 EMT 进程，使肿瘤细胞的侵袭能力增强[16]。Toulany等[17]研究显示IR可激活乳腺癌细胞表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)，促进Akt磷酸化，进而激活p38/Akt和PI3K/Akt信号转导通路，诱导肿瘤细胞发生EMT，增强乳腺癌细胞侵袭转移能力。Zhang等[18]研究显示IR可显著下调食管癌细胞PTEN的表达，促使Akt磷酸化水平增加，通过激活PI3K/Akt信号通路促进EMT的发生。由此可见，本研究结果表明IR能激活鼻咽癌CNE-2细胞中的PI3K/Akt通路，使Akt磷酸化水平升高，促进CNE-2细胞发生EMT改变。

综上所述，本研究结果证实X线电离辐射能够诱导人鼻咽癌CNE-2细胞发生EMT，并促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力，其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。然而，PI3K/Akt信号通路下游调控分子是否参与以及PI3K/Akt是否与其它信号通路共同促进CNE-2细胞的EMT进程还有待更深入的研究。